Caractérisation de l’interaction d’HOXA5 avec SMAD1, SOX2 et TSHZ3 en cellules animales

Details

Supervisors

Gofflot, Françoise

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

Les gènes Hox, qui codent pour des facteurs de transcription, ont été surtout étudiés pour leur rôle crucial dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur durant le développement embryonnaire. Des données plus récentes ont cependant révélé que l'expression de 24 gènes Hox est toujours présente dans le cerveau postnatal et adulte. Parmi ceux-ci, ce mémoire cible spécifiquement Hoxa5. La protéine HOXA5 est détectée dans le cerveau adulte et enrichie dans les noyaux pré-cérébelleux situés dans la région du pont et de la moelle allongée. Ces observations, associées à des analyses de transcriptomiques, suggèrent une importance fonctionnelle d'HOXA5 dans le développement, le raffinement et la plasticité synaptique des circuits pré-cérébelleux. Bien que de nouvelles fonctions d’HOXA5 soient envisagées, son mécanisme d’action reste encore à ce jour à élucider. Ainsi, l'étude de partenaires fonctionnels, tels que d'autres facteurs de transcription, se révèle cruciale pour comprendre la sélectivité, l’affinité et la spécificité de liaison des protéines HOX. L'objectif de ce mémoire est donc de déterminer si la localisation et la spécificité de liaison d’HOXA5 à la chromatine sont influencées par SMAD1, SOX2 et TSHZ3, trois facteurs de sélectionnés sur base de données de la littérature, et de données préliminaires, suggérant des interactions protéines/protéines fonctionnelles avec HOXA5 dans les neurones post-mitotiques. Afin de tester nos hypothèses, la première partie de ce travail visait à évaluer l’impact de la présence de SMAD1, SOX2 et TSHZ3 sur la localisation d’HOXA5 à la chromatine par western blot. Les résultats obtenus ont montré que TSHZ3 pourrait relocaliser HOXA5 à la chromatine, ou inversement, car TSHZ3 et HOXA5, en présence l’un de l’autre, semblent plus présents dans la fraction insoluble que lorsqu’ils sont seuls. Ensuite, SOX2 avec HOXA5 est moins présent au niveau de la chromatine que lorsque SOX2 est seul suggérant qu’ils pourraient interagir avant de se lier à la chromatine. Enfin, en présence de SMAD1, HOXA5 semble être plus présent au niveau de la fraction soluble. HOXA5 et SMAD1 pourraient se rencontrer et interagir au niveau du cytoplasme pour éventuellement accomplir des fonctions dans la transduction du signal. Nous n’avons cependant pas répété ces analyses au vu des nombreux problèmes méthodologiques rencontrés, des résultats peu reproductibles et du caractère énergivore de ces expériences. La deuxième partie avait pour objectif l’étude de l’interaction d’HOXA5 avec SMAD1, SOX2 et TSHZ3 à la chromatine par Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA). Les motifs d’ADN liés par HOXA5 n’étant pas encore connus, la sonde UCE 2.12, étudiée par Lampe et al. (2008) a été utilisée pour ces expériences. Les résultats obtenus nous ont permis d’avancer dans la compréhension de la spécificité de liaison d’HOXA5 à la chromatine mais également d’approfondir les connaissances sur l’interaction entre HOXA5 et SOX2. En effet, la liaison d’HOXA5 et SOX2 à l’UCE 2.12 a pu être mise en évidence. La spécificité de liaison d’HOXA5 à la sonde ne semble pas dépendre de ces interactions avec les protéines SMAD1, SOX2 et TSHZ3. Nous avons mis en évidence que SOX2 se lie à l’UCE 2.12 sous forme de monomère, d’homodimère et d’hétérodimère avec HOXA5. Par BIFC, il a été démontré que SOX2 était capable d’homodimériser et qu’HOXA5 a un impact négatif sur cette homodimérisation. De plus, SOX2 semble avoir également un impact négatif sur l’interaction entre HOXA5 et SOX2. Ces résultats suggèrent que ces 2 protéines sont en compétition pour interagir avec SOX2.Ces données offrent de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires sous-jacents et les implications potentielles des partenaires fonctionnels sur la (re)localisation et spécificité de liaison d’HOXA5 à l’ADN, mais également sur les fonctions d’HOXA5 dans le cerveau postnatal. Hox genes, which code for transcription factors, have been studied primarily for their crucial role in the establishment of the anterior-posterior axis during embryonic development. However, more recent data has revealed that the expression of 24 Hox genes is still present in the postnatal and adult brain. Among these, this thesis specifically targets Hoxa5. The protein HOXA5 is detected in the adult brain and enriched in the pre-cerebellar nuclei located in the pontine region and the medulla oblongata. These observations, combined with transcriptomic analyses, suggest the functional importance of HOXA5 in the development, refinement and synaptic plasticity of pre-cerebellar circuits. Although new functions for HOXA5 are being considered, its mechanism of action has yet to be elucidated. The study of functional partners, such as other transcription factors, is therefore crucial to understanding the selectivity, the affinity and the binding specificity of HOX proteins. The aim of this thesis is therefore to determine whether the localization and specificity of HOXA5 binding to chromatin are influenced by SMAD1, SOX2 and TSHZ3, three factors selected on the basis of data from the literature and preliminary data suggesting functional protein/protein interactions with HOXA5 in post-mitotic neurons. In order to test our hypotheses, the first part of this work aimed to evaluate the impact of the presence of SMAD1, SOX2 and TSHZ3 on the localization of HOXA5 to chromatin by western blot. The results showed that TSHZ3 could relocate HOXA5 to chromatin, or vice versa, as TSHZ3 and HOXA5, in the presence of each other, appear to be more present in the insoluble fraction than when they are alone. Secondly, SOX2 with HOXA5 is less present in chromatin than when SOX2 is alone, suggesting that they may interact before binding to chromatin. Finally, in the presence of SMAD1, HOXA5 appears to be more present in the soluble fraction. HOXA5 and SMAD1 could meet and interact in the cytoplasm to potentially perform functions in signal transduction. However, we did not repeat these analyses in view of the numerous methodological problems encountered, the poorly reproducible results and the energy-consuming nature of these experiments.The second part aimed to study the interaction of HOXA5 with SMAD1, SOX2 and TSHZ3 on chromatin using Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA). As the DNA motifs bound by HOXA5 are not yet known, the UCE 2.12 probe studied by Lampe et al (2008) was used for these experiments. The results obtained enabled us to make progress in our understanding of the specificity of HOXA5 binding to chromatin and also to improve our knowledge of the interaction between HOXA5 and SOX2. The binding of HOXA5 and SOX2 to UCE 2.12 was demonstrated. The specificity of HOXA5 binding to the probe does not seem to depend on these interactions with the SMAD1, SOX2 and TSHZ3 proteins. We demonstrated that SOX2 binds to UCE 2.12 as a monomer, homodimer and heterodimer with HOXA5. By BIFC, it was shown that SOX2 was able to form a homodimer and that HOXA5 had a negative impact on this homodimerization. Furthermore, SOX2 also appears to have a negative impact on the interaction between HOXA5 and SOX2. These results suggest that these 2 proteins are in competition to interact with SOX2.These data offer new insights into the underlying molecular mechanisms and the potential implications of functional partners on the (re)localization and specificity of HOXA5 binding to DNA, but also on the functions of HOXA5 in the postnatal brain.