Caractérisation fonctionnelle de la bactériocine BlpK produite par Streptococcus salivarius

Details

Supervisors

Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

Pour contrer l’augmentation de la résistance bactérienne aux antibiotiques, des alternatives doivent rapidement être trouvées. Parmi les différentes possibilités, l’équipe du Professeur Pascal Hols se penche sur l’étude des bactériocines. Celles-ci sont des peptides secrétés par les bactéries qui ont des propriétés antibactériennes. Nous nous intéressons plus particulièrement aux bactériocines de la souche Streptococcus salivarius HSISS4. Cette souche commensale du tractus digestif humain produit un cocktail composé de six bactériocines (BlpK, SlvV, SlvW, SlvX, SlvY et SlvZ) qui sont linéaires et non modifiées post-traductionnellement. Parmi ces dernières, BlpK est celle qui a la plus grande activité cytotoxique et le spectre d’action le plus large. Son mécanisme d’action semble être la formation d’un nanopore dans la membrane qui conduirait à l’arrêt de croissance ou la mort de la cellule. Pour ce faire, BlpK interagirait avec un récepteur spécifique se trouvant dans la membrane cible. L’interaction entre le récepteur et la bactériocine induirait ensuite l’oligomérisation du peptide et son insertion dans la bicouche lipidique. Finalement, le pore formé provoquerait la perte de matériel cellulaire. L’objectif principal de ce travail est de caractériser le mécanisme d’action de BlpK par la détermination des acides aminés essentiels pour l’activité de la bactériocine. En premier lieu, nous avons réalisé un alanine scanning sur la bactériocine qui consiste à muter chaque résidu un par un en alanine. Si un résidu se trouve être important, un changement d’activité de la bactériocine devrait être observé. De cette manière, 45 mutants ont été générés dont l’activité a été testée in vivo et in vitro sur la souche indicatrice Lactococcus lactis IL1403. Quatre classes de résidus essentiels ressortent de ces résultats : les cystéines, les glycines, les acides aminés chargés positivement et les acides aminés aromatiques. Pour chacune de ces classes, des mutants supplémentaires ont été construits pour déterminer les propriétés importantes de ces résidus. Pour finir, l’analyse de la structure prédite de BlpK nous a permis d’émettre des hypothèses concernant le rôle des résidus essentiels identifiés. En second lieu, nous avons investigué l’immunité de HSISS4 pour BlpK. Pour trouver le gène d’immunité spécifique, le locus blpK-I a été ciblé en premier lieu. Ce locus comprend huit gènes dont blpK. Plusieurs mutations de ce locus ont été réalisées comme la délétion du locus entier ainsi que chaque gène individuellement. La croissance et l’activité de ces mutants ont été testées dans différentes conditions (en présence de BlpK synthétique, en présence d’une molécule inductrice,…). Dans ces tests, nous avons remarqué que les mutants déficient pour le gène bkiP présentaient des difficultés de croissance en présence de BlpK. De ce fait, nous avons pu identifier BkiP comme le peptide d’immunité spécifique à BlpK. En revanche, le mécanisme d’immunité n’est pas encore connu même si plusieurs hypothèses ont pu être émises. De plus, le gène blpI, qui appartient au locus blpK-I, pourrait également intervenir dans l’immunité de HSISS4. Cependant, l’immunité conférée par BlpI serait générale et pourrait agir contre des bactériocines produites par d’autres bactéries. Pour conclure, les données de ce travail nous ont permis de mieux comprendre le mécanisme d’action de BlpK et son immunité. Néanmoins, une étude plus approfondie devra être réalisée pour caractériser en détail les mécanismes moléculaires impliqués. La compréhension complète du mécanisme d’action de cette bactériocine pourrait permettre son optimisation en vue de l’utiliser à des fins médicales. En effet, elle pourrait être utile pour combattre des bactéries pathogènes et résistantes aux antibiotiques. Par exemple, BlpK montre une activité contre Staphylococcus aureus et Enterococcus faecium, deux espèces sur la liste prioritaire de l’Organisation Mondiale de la Santé. To tackle the growing problem of antibiotic resistance in bacteria, alternatives must be found quickly. Among the different possibilities, the team of Professor Pascal Hols studies bacteriocins that are secreted peptides by bacteria with antibacterial properties. We particularly investigate bacteriocins of the strain Streptococcus salivarius HSISS4. This commensal strain of the human digestive tract produces a cocktail composed of six bacteriocins (BlpK, SlvV, SlvW, SlvX, SlvY and SlvZ) which are linear and not modified post-translationally. Out of these, BlpK has the highest cytotoxic activity and the broadest spectrum of activity. Its mechanism of action seems to be the formation of a nanopore into the membrane that would lead to growth arrest or cell death. We hypothesize that BlpK interacts with a specific receptor of the target membrane that would induce BlpK oligomerization and its insertion into the lipid bilayer. Finally, the pore formation would result in the loss of cell content. The main goal of this work is to characterize the action mechanism of BlpK by determining the key amino acids required for bacteriocin activity. First, we performed an alanine scanning on the bacteriocin, which consists in mutating each peptide residue one by one into an alanine. In this way, 45 mutants were generated whose activity was tested in vivo and in vitro with the indicator strain Lactococcus lactis IL1403. Four classes of key residues emerged from these results: cysteines, glycines, positively charged amino acids and aromatic amino acids. For each of these classes, additional mutants were designed to determine the important properties of these residues. Finally, the analysis of the predicted BlpK structure allowed us to make assumptions about the role of the identified essential residues. Second, we investigated the immunity of HSISS4 against BlpK. To find the immunity gene specific to BlpK, we started our investigations with the blpK-I locus. This locus consists of eight genes including blpK. Several mutants of this locus were generated such as the deletion of the entire locus and the removal of each gene individually. The growth and activity of these mutants were tested under different conditions (in the presence of synthetic BlpK, in the presence of an inductive molecule, etc). In these tests, we noted that the growth of mutants deficient for the bkiP gene was strongly affected in presence of BlpK. These results allowed us to identify BkiP as the specific BlpK immunity peptide. Although the immunity mechanism is not yet known, different hypotheses were proposed such as direct interactions with BlpK and/or the receptor. In addition, the blpI gene, which belongs to the blpK-I locus, may also be involved in HSISS4 immunity. However, BlpI-mediated immunity would be general and active against bacteriocins produced by other bacteria. To conclude, the data from this work allow us to better understand the action mechanism of BlpK and its immunity. However, a more detailed study still needs to be carried out to characterize the molecular mechanisms involved. The complete understanding of the activity of this bacteriocin would allow to optimize it for medical applications. Indeed, it could be useful for fighting pathogenic and antibiotic-resistant bacteria. For example, BlpK shows activity against Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium that are two species on the priority list of World Health Organization.