Conversion d'un facteur de transcription homodimérique en un hétérodimère avec des relations effectrices plus complexes

Details

Supervisors

Soumillion, Patrice ; Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

Les facteurs de transcription sont des protéines intéressantes étant donné leur rôle dans les processus de régulation des voies métaboliques. Contrôler l’activation et les cibles d’un facteur de transcription permet donc de contrôler l’expression de gènes spécifiques et ouvre la voie vers l’élaboration de nouveaux circuits génétiques. En biotechnologie, les facteurs de transcription de la famille RNPP sont des cibles particulièrement intéressantes étant donné leur rôle dans le contrôle du comportement bactérien. Au cœur des mécanismes de Quorum Sensing chez les bactéries Gram+, les protéines de la famille RNPP dirigent en effet des processus cruciaux tels que la sporulation, la virulence, la conjugaison… Parmi les membres de cette famille, la protéine ComR contrôle le processus de transformation naturelle chez certains streptocoques dont Streptococcus thermophilus. Dans le système ComRS qui est un système de régulation de l’entrée en compétence, ComR lie le phéromone mature XIP pour son activation puis permet l’augmentation de la production de la pré-phéromone ComS et la production du facteur sigma σx qui est à l’origine de l’entrée en compétence. En 2016, une étude structurelle de ComRSth menée par Talagas et al. a permis d’indiquer que la protéine doit lier le XIP et dimériser pour lier l’ADN. De plus, cette étude a permis de proposer un mécanisme d’activation de ComR qui a été complété récemment par Ledesma-Garcia et al. Cependant, plusieurs éléments autour de ce mécanisme restent flous. En 2020, une étude utilisant l’ingénierie génétique sur la spécificité de ComRSth à son peptide endogène (XIPSth) et au peptide de Streptococcus vestibularis (XIPSve) a proposé une piste intéressante pour le contrôle de l’activation de ComRSth. En effet, cette étude a démontré que l’introduction de 5 substitutions (R92G, V205A, S248G, S289K et I290T) dans la poche de liaison au XIP de ComRSth permet le changement de spécificité et la reconnaissance du XIPSve. Ce mémoire a pour but de contrôler l’activation de ComRSth en convertissant la protéine en hétérodimères strictes avec une spécificité double au peptide. L’hétérodimérisation strictes de ComRSth nécessitera plusieurs étapes telles que la prévention de l’homodimérisation, l’utilisation d’une seconde copie synthétique du gène, la co-expression et le changement de spécificité au XIP. Dans un premier temps, nous nous intéresserons au ciblage de deux paires de ponts salins présents à l’interface de dimérisation pour prévenir l’homodimérisation. L’inversion des charges formant les ponts permettra l’introduction de répulsion dans les paires de ponts salins et l’impact sur l’activité transcriptionnelle sera analysée. Ensuite, nous tenterons d’utiliser une copie synthétique de comR afin d’éviter des phénomènes de recombinaison homologue lors de la co-expression. La fonctionnalité de la copie synthétique sera vérifiée aux loci utilisés pour la co-expression. Dans un troisième temps, la co-expression de mutants prévenant l’homodimérisation mais permettant l’hétérodimérisation sera réalisée. Enfin, nous introduirons 5 mutations dans la poche de liaison du XIP d’une copie de comR afin de changer la spécificité du peptide et entrainer la reconnaissance du XIPSve. Cette dernière étape nous permettra de contrôler la formation des hétérodimères qui ne sera permise qu’en présence des deux peptides (XIPSth et XIPSve). Ce projet de mémoire s’inscrit dans une volonté de mieux comprendre le fonctionnement de ComR et l’assemblage du complexe ComR/XIP/ADN via la conversion en hétérodimères. Bien que ce projet ne permet pas d’élucider de nouveaux éléments autour de ComR, il constitue le point de départ d’un projet plus vaste ayant pour objectif d’élucider l’activation de ComR et l’assemblage du complexe via la formation d’un complexe à 5 partenaires (2 ComRs, 2 XIP et 1 ADN). Transcription factors are interesting proteins because of their role in regulation process of metabolic pathways. Controlling the activation and targets of a transcription factor therefore allows the control of the expression of specific genes and opens the way to the development of new genetic circuits. In biotechnology, transcription factors of the RNPP family are particularly interesting targets given their role in controlling bacterial behaviour. At the heart of the Quorum Sensing mechanisms in Gram+ bacteria, the proteins of the RNPP family direct crucial processes such as sporulation, virulence, conjugation, etc. Among the members of this family, the ComR protein controls the natural transformation process in certain streptococci including Streptococcus thermophilus. In the ComRS system, which is a regulatory system for entry into competence, ComR binds the mature pheromone XIP for its activation and then allows the increase in the production of the pre-pheromone ComS and the production of the sigma factor σx which is at the origin of entry into competence. In 2016, a structural study of ComRSth by Talagas et al. indicated that the protein must bind XIP and dimerise to bind DNA. In addition, this study proposed a mechanism of ComR activation that was recently completed by Ledesma-Garcia et al. However, several elements around this mechanism remain unclear. In 2020, a genetically engineered study on the specificity of ComRSth to its endogenous peptide (XIPSth) and to the peptide of Streptococcus vestibularis (XIPSve) proposed an interesting avenue for the control of ComRSth activation. Indeed, this study demonstrated that the introduction of 5 substitutions (R92G, V205A, S248G, S289K and I290T) in the XIP-binding pocket of ComRSth allows the change of specificity and recognition of XIPSve. This master thesis aims to control the activation of ComRSth by converting the protein into strict heterodimers with dual specificity to the peptide. Strict heterodimerisation of ComRSth will require several steps such as prevention of homodimerisation, use of a second synthetic copy of the gene, co-expression and change of specificity to XIP. First, we will focus on targeting two pairs of salt bridges present at the dimerisation interface to prevent homodimerisation. The inversion of the charges forming the bridges will allow the introduction of repulsion into the salt bridge pairs and the impact on transcriptional activity will be analysed. Next, we will attempt to use a synthetic copy of comR to avoid homologous recombination phenomena during co-expression. The functionality of the synthetic copy will be verified at the loci used for co-expression. In a third step, the co-expression of mutants preventing homodimerisation but allowing heterodimerisation will be performed. Finally, we will introduce 5 mutations in the XIP binding pocket of a copy of comR to change the specificity of the peptide and cause the recognition of XIPSve. This last step will allow us to control the formation of heterodimers which will only be allowed when both peptides (XIPSth and XIPSve) are present. This master thesis project is part of a desire to better understand the functioning of ComR and the assembly of the ComR/XIP/DNA complex via conversion into heterodimers. Although this project does not elucidate new elements around ComR, it is the starting point of a larger project aiming to elucidate the activation of ComR and the assembly of the complex via the formation of a 5-partners complex (2 ComRs, 2 XIPs and 1 DNA).