Mise au point de l’analyse de tumeurs murines par immunohistofluorescence pour détecter les vaisseaux sanguins exprimant GARP et les cellules répondant au TGF-β1

Details

Supervisors

Lucas, Sophie ; Bertrand, Charlotte

Degree label

Master [120] en sciences biomédicales, à finalité approfondie

Abstract

A l'heure actuelle, les immunothérapies du cancer sont confrontées à des résistances tumorales et de nouvelles cibles thérapeutiques sont explorées par de nombreux laboratoires de recherche. Chez Sophie Lucas, l’intérêt se porte sur le TGF-β1, cytokine immunosuppressive produite par les lymphocytes T régulateurs (Tregs) dans le stroma tumoral, qui influence négativement la fonction des lymphocytes T CD8+ anti-tumoraux. L’objectif de ses recherches vise à bloquer, avec un anticorps monoclonal, l’activation du TGF-β1 dans les Tregs en ciblant la protéine d’ancrage du TGF-β1 latent à leur surface connue sous le nom de GARP. Cette protéine transmembranaire participe au processus d’activation du TGF-β1 latent et est exprimée par plusieurs types cellulaires incluant les Tregs stimulés, les lymphocytes B activés, les plaquettes, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Cependant, il n’a pas encore été prouvé pour tous ces types cellulaires qu’ils soient capables d’activer le TGF-β1 latent de manière dépendante de GARP. L’étude des effets de cet anticorps anti-GARP : TGF-β1 sur les cellules exprimant GARP dans des tumeurs et par conséquent sur les cellules répondant au TGF-β1 implique la mise au point de techniques pour détecter ces cellules et de méthodes pour les analyser. L’objectif de ce travail est de mettre au point un quadruple marquage en IHF des cellules totales, des vaisseaux bordés de cellules endothéliales exprimant GARP et des cellules répondant au TGF-β1 sur des coupes de tumeurs murines MC38 congelées. Ensuite, il faut déterminer une méthode pour analyser dans ces tumeurs la densité des vaisseaux sanguins exprimant GARP, l’abondance des cellules répondant au TGF-β1 et les relations spatiales entre ces structures vasculaires GARP+ et ces cellules répondant au TGF-β1. Pour ce faire, nous avons mis au point différents marquages nous permettant de détecter les cellules totales (grâce au marqueur nucléaire DAPI), les cellules endothéliales (par un anticorps anti-CD146), la protéine GARP (par un anticorps anti-GARP) et les cellules répondant au TGF-β1 (par un anticorps anti-pSMAD3). Pour l’analyse de ces coupes de tumeurs MC38 marquées, 2 programmes du logiciel HALO ont été utilisés. Au terme de ces mises au point, nous avons observé que la densité des vaisseaux exprimant GARP et l’abondance des cellules pSMAD3 positives peuvent être mesurées dans les coupes de tumeurs MC38 mais que l’analyse de la distribution de ces structures vasculaires ou de ces cellules donne des résultats peu reproductibles. Enfin, il semblerait qu’une corrélation positive existe entre les densités des cellules pSMAD3 positives et les vaisseaux exprimant GARP.