Étude de la régulation de la localisation subcellulaire et de la stabilité du facteur de transcription HOXA5 dans le cerveau murin postnatal

Details

Supervisors

Gofflot, Françoise

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

Le gène Hoxa5 fait partie de la famille des gènes Hox qui codent pour des facteurs de transcription jouant un rôle crucial durant le développement embryonnaire. Des études récentes de l’équipe du Pr. Gofflot montrent que Hoxa5 est également exprimé dans le cerveau aux stades postnatal et adulte, où il aurait un rôle dans l’établissement, le raffinement ou la plasticité des circuits précérébelleux. Sur base de ces données, 2 projets sont en cours afin de déterminer les fonctions de la protéine HOXA5 dans le cerveau postnatal et ses mécanismes d’action moléculaire dans les neurones post-mitotiques. Ce mémoire s’intègre dans le volet concernant l’étude des mécanismes d’action de HOXA5 et a pour objectif d’investiguer la régulation de la localisation subcellulaire et de la stabilité de la protéine HOXA5 afin d’appréhender la régulation de son activité transcriptionnelle dans le cerveau postnatal. Suite à une étude intéractomique et à l’analyse de la littérature, 7 candidats interactants ont été identifiés comme pouvant impacter la localisation subcellulaire (IPO7, CRM1, KPC2, KPC1, PPP1CB) et la stabilité (UBE3A, UBE2S, KPC2, KPC1) de HOXA5. L’étude de ces interactants, de leur impact sur la localisation et la stabilité de HOXA5 ainsi que l’identification des domaines protéiques requis pour cette interaction devrait permettre d’améliorer notre compréhension des mécanismes d’action de HOXA5. Dans un premier temps, nous avons procédé à la validation des interactions ente ces candidats et HOXA5 par les méthodes de co-précipitation et de Bimolecular Fluorescence Complementation. Ainsi, nous avons confirmé que HOXA5 interagissait avec IPO7, CRM1, KPC2 et UBE2S bien que des répétitions biologiques soient nécessaires pour certains candidats. L’étude de l’interaction entre HOXA5 et PPP1CB est prometteuse mais celle-ci doit encore être confirmée. Par contre, HOXA5 ne semble pas interagir avec KPC1 et son interaction avec UBE3A n’a pas pu être mise en évidence de manière concluante. Ensuite, l’impact des candidats sur la localisation subcellulaire et la stabilité de HOXA5 a été abordée, et nos études préliminaires permettent de conclure que la localisation de ces interactions est nucléaire pour tous les candidats mais également cytoplasmique pour CRM1 et UBE3A. Enfin, l’impact des interactions sur l’activité transcriptionnelle de HOXA5 a été étudiée par l’approche de dual-luciférase, pour IPO7, CRM1, KPC2 et KPC1, et UBE3A. Nos premières données montrent que IPO7 et CRM1 semblent impacter négativement l’activité transcriptionnelle de HOXA5 alors que KPC2 ne semble pas avoir d’impact et que UBE3A montre une tendance positive sur son activité. En conclusion, nous avons pu confirmer 4, voire 5, des candidats sélectionnés comme étant des interactants de HOXA5, ouvrant de réelles perspectives dans la compréhension de ses mécanismes d’action. Nos données préliminaires sur leur impact fonctionnel semblent indiquer que IPO7 et KPC2 ne seraient pas impliqués dans l’import et l’export de HOXA5, respectivement. A l’opposé, nos données semblent indiquer que CRM1 pourrait être impliqué dans l’export de HOXA5. Finalement, UBE3A ne semble pas déstabiliser HOXA5 comme nous l’avions proposé. Dans la suite de ce projet, il serait notamment intéressant d’identifier, pour les candidats confirmés, les domaines responsables des interactions par l’étude de mutants de délétion. En parallèle, pour intégrer ces données dans le contexte du cerveau postnatal, inhérent à ce projet, le patron d'expression des candidats validés doit également être étudié par hybridation in situ et, si des anticorps spécifiques sont disponibles, au niveau protéique par immunofluorescence, sur des coupes de cerveaux ou des neurones mis en culture. Ceci permettrait d’analyser en contexte physiologique la co-expression des différents acteurs étudiés dans ce mémoire avec HOXA5. The Hoxa5 gene belongs to the Hox genes family that code for transcription factors playing crucial roles during embryonic development. Recent studies by Prof. Gofflot's team show that Hoxa5 is also expressed in the postnatal and adult brain, where it is thought to play a role in the establishment, refinement or plasticity of the precerebellar circuits. Based on these data, two projects are underway to determine the functions of HOXA5 in the postnatal brain and its molecular mechanisms of action in post-mitotic neurons. This master thesis is part of the project exploring the mechanisms of action of HOXA5 and aims to investigate the regulation of HOXA5 subcellular localisation and stability in order to apprehend the regulation of its transcriptional activity in the postnatal brain. Based on an interactomic study and on literature analysis, 7 candidate interactors were identified as being able to impact on the subcellular localisation (IPO7, CRM1, KPC2, KPC1, PPP1CB) and stability (UBE3A, UBE2S, KPC2, KPC1) of HOXA5. The study of these interactants, their impact on HOXA5 localisation and stability and the identification of the protein domains required for this interaction should improve our understanding of HOXA5 molecular mechanisms of action. First, we validated the interactions between these candidates and HOXA5 by co-precipitation and Bimolecular Fluorescence Complementation assays. Thereby, we confirmed that HOXA5 interact with IPO7, CRM1, KPC2 and UBE2S although biological repeats are required for some candidates. The study of the interaction between HOXA5 and PPP1CB is promising but still needs to be confirmed. On the other hand, HOXA5 does not appear to interact with KPC1 and its interaction with UBE3A could not be conclusively demonstrated. Next, the impact of the candidates on the subcellular localisation and stability of HOXA5 was tackled, and our preliminary studies allow to conclude that the localisation of these interactions is nuclear for all candidates but also cytoplasmic for CRM1 and UBE3A. Finally, the impact of the interactions on the transcriptional activity of HOXA5 was studied by the dual-luciferase approach, for the IPO7, CRM1, KPC2, KPC1, and UBE3A interactants. Our first data show that IPO7 and CRM1 seem to negatively impact the transcriptional activity of HOXA5 while KPC2 does not seem to have any impact and UBE3A shows a positive trend on its activity. In conclusion, we were able to confirm four or even five of the selected candidates as being HOXA5 interactors, opening real perspectives in the understanding of its mechanisms of action. Our preliminary data on their functional impact suggest that IPO7 and KPC2 are not involved in the import and export of HOXA5, respectively. In contrast, our data suggest that CRM1 may be involved in HOXA5 export. Finally, UBE3A does not appear to destabilise HOXA5 as we hypothesized. In the perspectives of this project, it would be of particular interest to identify, for the confirmed candidates, the domains responsible for the interactions by studying deletion mutants. In parallel, in order to integrate these data in the context of the postnatal brain, inherent to this project, the expression pattern of the validated candidates should also be studied by in situ hybridisation and, if specific antibodies are available, at the protein level by immunofluorescence, on brain sections or cultured neurons. This would allow analysing the co-expression of the different players studied in this work with HOXA5 in a physiological context.