Etude du système CovM-CovRS de régulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius

Details

Supervisors

Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité spécialisée: biotechnologie

Abstract

Face au nombre croissant des bactéries antibio-résistantes, les scientifiques cherchent de nouvelles solutions pour lutter contre les bactéries pathogènes. Parmi celles-ci, le laboratoire de Pr. Pascal Hols étudie des peptides antimicrobiens de type bactériocine et plus particulièrement ceux produits par Streptoccocus salivarius. Cette espèce est une bactérie commensale de l’Homme retrouvée dans la bouche, le nasopharynx et le tube digestif et qui produit un grand nombre de bactériocines. Dans notre quête d’en apprendre plus sur cette bactérie prometteuse, nous nous intéressons à la régulation de son entrée en compétence qui partage sa régulation avec celle de la production de bactériocines. Nous nous concentrons sur la régulation distale de la compétence par le système CovRS. La protéine CovR, un régulateur de réponse, inhibe la compétence lorsqu’elle est phosphorylée. Son histidine kinase associée, CovS, régule son état de phosphorylation en fonction de stimuli qui ne sont pas encore bien connus à ce jour. La protéine CovM, une histidine kinase-like, est suspectée d’interagir avec CovS pour influencer son activité et ainsi l’état de compétence de S. salivarius. L’objectif général de ce mémoire est d’avoir une meilleure compréhension du rôle de CovM dans la régulation distale de la compétence chez S. salivarius. Dans ce travail, nous voulions déterminer quelle partie de CovM (membranaire vs cytoplasmique) était nécessaire à son fonctionnement et établir si CovM interagit avec CovS. Pour déterminer si la partie cytoplasmique de CovM était nécessaire à son fonctionnement, nous avons généré une série de mutants de délétion de cette partie et nous avons étudié l’impact de ces délétions sur la régulation de la compétence. Cette étude nous a permis de déterminer que la partie cytoplasmique de CovM était requise pour son fonctionnement. Ensuite, pour étudier une interaction potentielle entre CovM et CovS in vivo, nous leur avons fusionné les deux sous-unités complémentaires de la luciférase Nanoluc. Les résultats obtenus par cette approche suggèrent que ces deux partenaires interagissent soit directement, soit via la formation d’un complexe multiprotéique. Pour confirmer ces résultats, nous avons également fusionné des étiquettes d’affinité à ces deux protéines d’intérêt afin de pouvoir les capturer spécifiquement au départ de leur hôte d’origine. Les souches construites seront utiles dans le futur pour co-capturer un éventuel complexe CovM-CovS, ainsi que d’autres interactants de ces deux protéines qui seront identifiés par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus au cours de ce mémoire renforcent notre hypothèse que CovM est un modulateur direct de l’activité du système CovRS où la partie cytoplasmique de CovM serait requise pour moduler l’activité kinase/phosphatase de la protéine CovS, dictant ainsi l’entrée en compétence chez S. salivarius. Faced with the growing number of antibiotic-resistant bacteria, scientists are looking for new solutions to combat pathogenic bacteria. Among these, Prof. Pascal Hols’ laboratory is studying antimicrobial peptides of the bacteriocin type, and more specifically those produced by Streptoccocus salivarius. This species is a human commensal bacterium found in the mouth, nasopharynx and digestive tract, and produces a large number of bacteriocins. In our quest to learn more about this promising bacteria, we are interested in the regulation of its entry into competence, which shares its regulation with that of bacteriocin production. We are focusing on the distal regulation of competence by the CovRS system. The CovR protein, a response regulator, inhibits competence when it is phosphorylated. Its associated histidine kinase, CovS, regulates its phosphorylation state according to stimuli that are not yet well understood. The CovM protein, a histidine kinase-like protein, is suspected of interacting with CovS to influence its activity and thus the state of competence in S. salivarius. The general objective of this master’s thesis is to have a better understanding of CovM role in competence’s distal regulation in S. salivarius. In this work, we wanted to determine which part of CovM (membrane vs. cytoplasmic) was necessary for its function and to establish whether CovM interacts with CovS. To determine whether the CovM cytoplasmic part was necessary for its function, we generated a series of deletion mutants of this part and studied the impact of these deletions on competence regulation. This study enabled us to determine that the CovM cytoplasmic part was required for its function. Next, to study a potential interaction between CovM and CovS in vivo, we fused two complementary subunits of the Nanoluc luciferase to them. The results obtained using this approach suggest that these two partners interact either directly or via the formation of a multiprotein complex. To confirm these results, we also fused affinity tags to these two proteins of interest so as to be able to capture them specifically from their original host. The strains constructed will be useful in the future for co-capturing a possible CovM-CovS complex, as well as other interactants of these two proteins that will be identified by mass spectrometry. The results obtained during this thesis reinforce our hypothesis that CovM is a direct modulator of the activity of the CovRS system, where the cytoplasmic part of CovM would be required to modulate CovS kinase/phosphatase activity, thus dictating entry into competence in S. salivarius.