Analyse fonctionnelle des régions promotrices du gène MAGE-4

Details

Supervisors

Boon, Thierry ; De Plaen, Etienne

Faculty

Faculté de médecine et médecine dentaire

Degree label

Mémoire de licence en technologie biomédicale

Abstract

Le gène MAGE-4 se caractérise par la présence de huit premiers exons qui sont splicés alternativement à un seul exon 2 et à un seul exon 3. Nous avons mesuré l’activité transcriptionnelle des régions promotrices situées en amont de trois de ces exons 1. Pour cela, nous avons introduit dans un plasmide rapporteur luciférase les trois régions promotrices de 0.2kb, 0.68kb et 0.6kb respectivement, obtenues après deux exonucléases successives. Les expériences de transfection transitoire dans la lignée cellulaire LB23-SARC, qui exprime MAGE-4 et dans la lignée MZ2-MEL qui ne l’exprime pas ont montré que ces promoteurs sont actifs dans les deux lignées. En transfectant des construction délétées et mutées du promoteur 1.5 de MAGE-4 dans les lignées cellulaires LB23-SARC et MZ-2MAL, nous avons pu déterminer trois régions. Cis-activatrices appelées A (-179 --> -89), B (-89 --> -41) et C (-41 -->-25). Ces trois régions contiennent des motifs consensus pour des facteurs de transcription de la famille Ets. La région A induit environ 50% de l’activité du promoteur 1.5 dans la lignée LB23-SARC, mais ne semble pas jouer de rôle dans la lignée MZ2-MEL. La région B induit 40% de l’activité du promoteur dans la lignée LB23-SARC et 90% dans la lignée MZ2-MAL. La région C induit environ 10% de l’activité transcriptionnelle dans les deux lignées. Des expériences de footprinting à la DNAse I ont confirmé que ces trois régions cis-activatrices fixaient des protéines nucléaires de la lignée LB23-SARC. La technique du retard sur gel avec un extrait nucléaire de cellules LB23-SARC en présence d’oligonucléotides compétiteurs contenant un site consensus Etc nous a montré que les protéines nucléaires se liaient au motif Ets des régions B et C. Des mutations ponctuelles introduites dans les motifs Ets des régions B et C ont confirmé que des facteurs de la famille Ets jouaient un rôle essentiel dans la régulation de l’activité du promoteur MAGE-4.