Effets des microparticules de polystyrène (pures ou en combinaison avec du MeHg) sur le processus de détoxification et le stress oxydant des cellules hépatiques et branchiales de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) : Mise au point méthodologique et premiers résultats

Details

Supervisors

KESTEMONT, Patrick ; OGER, Mathilde

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biologie des organismes et écologie

Abstract

Actuellement, le plastique est utilisé de manière quotidienne partout dans le monde et sa production ne cesse d’augmenter. Avec la mauvaise gestion des déchets, une partie importante des plastiques se retrouve dans l’environnement. En 2010, entre 4,8 et 12,7 millions de tonnes sont entrées dans l’océan et la quantité pourrait atteindre 250 millions de tonnes d’ici 2025. Une fois dans l’environnement, les plastiques subissent des événements de photo-oxydation et de thermo-oxydation qui les fragilisent. Ils se fragmentent ainsi en microplastiques (0,1 µm – 5 mm) sous l’action de facteurs abiotiques et biotiques. Cependant, les microplastiques peuvent également être manufacturés, sous forme de microbilles, pour être utilisés dans l’industrie cosmétique et de soins personnels et pour la nanomédecine. Ils se retrouvent donc facilement dans l’environnement via les eaux usées et pluviales. Ainsi, ils peuvent contaminer les organismes aquatiques par voie buccale, via leurs organes filtrants mais aussi par leurs branchies. N’étant pas digérés ou décomposés, ils s’accumulent dans l’intestin et les lamelles branchiales et peuvent également rejoindre d’autres organes, comme le foie, via le sang pour les plus petits d’entre eux. De plus, suite à leur surface apolaire et leur rapport surface/volume élevé, les microplastiques peuvent concentrer des polluants hydrophobes à leur surface, comme le méthylmercure (MeHg). L’impact physique et chimique des microplastiques sur la truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss a été étudié durant ce mémoire, en particulier sur les systèmes hépatique et branchial. Des cellules hépatiques (RTL-W1) et branchiales (RTgill-W1) ont été exposées à des microparticules de polystyrène seules (0,1 µg/mL ; 1 µg/mL ; 10 µg/mL), en combinaison avec du méthylmercure (0,2 µg/mL) et à du méthylmercure seul (0,2 µg/mL et 0,8 µg/mL) et les effets ont été observés au niveau de deux processus : la détoxification et le stress oxydant. Notre mémoire s’est d’abord consacré à la mise au point méthodologique et à la réalisation de pré-tests, car ces protocoles n’ont jamais été appliqués auparavant dans notre laboratoire d’accueil. Suite à différents problèmes relatifs à la lignée hépatique, nos expériences ont uniquement été réalisées sur les cellules RTgill-W1. En effet, des agglomérats, des changements dans la morphologie et de la mortalité ont été observés dans les cellules RTL-W1. Plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer ces observations, mais la présence d’un phénotype sénescent dans l’aliquot cellulaire reçu au départ semble être la plus probable. Des tests de cytotoxicité AlamarBlue (effet sur le métabolisme cellulaire) et CFDA-AM (effet sur l’intégrité de la membrane plasmique) ont été effectués sur les cellules RTgill-W1 exposées aux différentes conditions et pendant 12, 24 et 48h. Ils ont montré que le méthylmercure seul semblait impacter la viabilité cellulaire avec des effets dose et temps dépendants. En effet, les effets étaient plus prononcés pour la plus grande concentration en méthylmercure (0,8 µg/mL) et après 24 et 48h. Concernant les microparticules de polystyrène, aucun effet n’a été observé. Il est possible que celles-ci ne soient pas cytotoxiques aux doses testées ou que leur taille soit trop grande pour assurer une internalisation cellulaire. Concernant les processus de détoxification et de stress oxydant, l’activité de l’enzyme détoxifiante EROD n’a pas été détectée et aucun changement dans les activités des enzymes antioxydantes SOD et CAT n’a été observé. La présente étude n’a donc pas réellement pu démontrer s’il y avait un impact des microparticules pures et en combinaison avec du méthylmercure sur ces deux processus. Néanmoins, une première approche de la problématique a été apportée et des protocoles de base ont été établis et pourront être utilisés pour des expérimentations ultérieures. Currently, plastic is used daily all over the world and its production is increasing. With poor waste management, a significant part of plastics ends up in the environment. In 2010, between 4.8 and 12.7 million tons entered the ocean and the amount could reach 250 million tons by 2025. Once in the environment, plastics undergo photo-oxidation and thermo-oxidation events which weaken them. They thus fragment into microplastics (0.1 µm - 5 mm) under the action of abiotic and biotic factors. However, microplastics can also be manufactured, in the form of microbeads, for use in the cosmetics and personal care industry and for nanomedicine. They are therefore easily found in the environment via wastewater and rainwater. Thus, they can contaminate aquatic organisms through the mouth, through their filtering organs but also through their gills. Not being digested or broken down, they accumulate in the intestine and gill lamellae and can also reach other organs, such as the liver, via the blood for the smallest of them. In addition, due to their non-polar surface and their high surface/volume ratio, microplastics can concentrate hydrophobic pollutants on their surface, such as methylmercury (MeHg). The physical and chemical impact of microplastics on the rainbow trout Oncorhynchus mykiss has therefore been studied here, in particular on its hepatic and branchial systems. For this, RTL-W1 and RTgill-W1 cells were exposed to polystyrene microparticles alone (0.1 µg/mL; 1 µg/mL; 10 µg/mL), in combination with methylmercury (0.2 µg/mL) and methylmercury alone (0.2 µg/mL and 0.8 µg/mL) and effects were observed in two processes : detoxification and oxidative stress. Our master thesis was first devoted to methodological development and the performance of pre-tests, as these protocols have never been applied before in our host laboratory. Following various problems relating to the hepatic line, our experiments were only carried out on RTgill-W1 cells. Indeed, agglomerates, changes in morphology and mortality were observed in RTL-W1 cells. Several hypotheses have been put forward to explain these observations, but the presence of a senescent phenotype in the cell aliquot initially received seems to be the most probable. AlamarBlue (effect on cell metabolism) and CFDA-AM (effect on the integrity of the plasma membrane) cytotoxicity tests were carried out on the RTgill-W1 cells exposed to the different conditions and for 12, 24 and 48 hours. They showed that methylmercury alone seemed to impact cell viability with dose and time dependent effects. Indeed, the effects were more pronounced for the highest concentration of methylmercury (0,8 µg/mL) and after 24 and 48 hours. Regarding polystyrene microparticles, no effect was observed. It is possible that these are not cytotoxic at the doses tested or that their size is too large to ensure cellular internalization. Regarding detoxification and oxidative stress processes, the activity of the detoxifying enzyme EROD was not detected and no changes in the activities of the antioxidant enzymes SOD and CAT were observed. Therefore, the present study could not really demonstrate whether there was an impact of pure microparticles and in combination with methylmercury on these two processes. Nevertheless, a first approach to the problem was provided and basic protocols were established and could be used for subsequent experiments.