Purification et caractérisation de L,D-transpeptidases d’Escherichia coli

Details

Supervisors

Soumillion, Patrice

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire

Abstract

L’utilisation des antibiotiques est la méthode principale dans la lutte contre les infections bactériennes. Une cible préférentielle est l’enveloppe bactérienne, plus spécifiquement la matrice de peptidoglycane et les enzymes en charge de sa biosynthèse. Néanmoins, les bactéries ont développé une série de mécanismes de résistance, rendant la recherche de nouvelles molécules et de cibles essentielle. Cet objectif requiert une compréhension approfondie de la structure, de la biosynthèse, de la régulation, de la dégradation et du recyclage de l’enveloppe bactérienne. L’assemblage de l’enveloppe fait notamment intervenir des réactions de transpeptidations qui, d’une part, réticulent le peptidoglycane par pontage entre brins peptidiques (aussi appelés muropeptides) et, d’autre part, attachent le peptidoglycane à des protéines ancrées dans la membrane externe. Les enzymes en charge de ces réactions sont les D,D-transpeptidases et les L,D-transpeptidases. Chez Escherichia coli, trois L,D-transpeptidases sont responsables de la formation de connexions entre le peptidoglycane et la membrane externe par l’intermédiaire de la lipoprotéine de Braun aussi appelée Lpp. Ce lien est formé entre la lysine C-terminale de la protéine et l’acide méso-diaminopimélique (mDAP) en 3ème position d’un muropeptide. Il est généralement accepté que la transpeptidation a lieu au départ d’un substrat tetrapeptidique avec libération d’une D-Alanine C-terminale mais ceci n’a jamais été démontré expérimentalement et des observations récentes au laboratoire suggèrent que la réaction nécessite plutôt un brin pentapeptidique avec libération d’un dipeptide D-Alanyl-D-Alanine. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail est de caractériser ces L,D-transpeptidases d’E. coli et d’identifier les substrats de ces enzymes. Pour ce faire, les gènes de trois L,D-transpeptidases ont été clonés dans des vecteurs d’expression cytoplasmique et périplasmique, fusionnés à une séquence encodant une queue de poly-histidine. Le protocole de purification a été optimisé. Les protéines purifiées n’ont montré aucune activité sur des substrats moléculaires mimant les muropeptides donneurs et l’extrémité acceptrice C-terminale de Lpp. Différentes analyses semblent suggérer que la cystéine du centre actif de ces L,D-transpeptidases soit sujette à une modification covalente aussi bien dans le cytoplasme que dans le périplasme. Toutefois, la nature de cette modification n'a pas pu être identifiée. Globalement, ce travail met en évidence les défis biochimiques pour l'étude de trois L,D-transpeptidases d'E. coli et fournit les preuves d'une modification inconnue du site actif qui pourrait avoir une importance mécaniste dans la biologie de ces enzymes. Une hypothèse serait que, dans leur cycle catalytique, ces enzymes existent principalement sous une forme acylée. The use of antibiotics is the main method in the fight against bacterial infections. A preferential target is the bacterial envelope, more specifically the peptidoglycan matrix and the enzymes in charge of its biosynthesis. Nevertheless, bacteria have developed a series of resistance mechanisms, thus making the search for new molecules and targets essential. This requires a thorough understanding of the structure, biosynthesis, regulation, degradation and recycling of the bacterial envelope. The assembly of the envelope notably involves transpeptidation reactions which, on the one hand, cross-link the peptidoglycan by bridging peptide strands (also called muropeptides) and, on the other hand, attach the peptidoglycan to proteins anchored in the outer membrane. The enzymes responsible for these reactions are D,D-transpeptidases and L,D-transpeptidases. In Escherichia coli, three L,D-transpeptidases are responsible for the formation of connections between the peptidoglycan and the outer membrane via Braun's lipoprotein also known as Lpp. This link is formed between the protein's C-terminal lysine and the meso-diaminopimelic acid (mDAP) in the 3rd position of a muropeptide. It is generally accepted that transpeptidation takes place from a tetrapeptide substrate with release of a C-terminal D-Alanine but this has never been experimentally demonstrated and recent observations in our laboratory suggest that the reaction rather requires a pentapeptide strand with release of a D-Alanyl-D-Alanine dipeptide. In this context, the aim of this work is to characterize these L,D-transpeptidases of E. coli and to identify the substrates of these enzymes. To this end, the genes of three L,D-transpeptidases were cloned into cytoplasmic and periplasmic expression vectors, fused to a sequence encoding a poly-histidine tail. The purification protocol was optimized. The purified proteins showed no activity on molecular substrates mimicking donor muropeptides and the C-terminal acceptor end of Lpp. Different results suggest that the cysteine at the active center of these L,D-transpeptidases is subject to covalent modification in both the cytoplasm and the periplasm. However, the nature of this modification could not be identified. Overall, this work highlights biochemical challenges for the study of three L,D-transpeptidases of E. coli and provides evidences of an unknown modification of the active site which could have a mechanistic importance in the biology of these enzymes. One hypothesis would be that, in their catalytic cycle, these enzymes exist mainly in an acylated form.