Etude du système CovM-CovRS dans la régulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius

Details

Supervisors

Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité didactique

Abstract

Les échanges de gènes sont fréquents dans le monde bactérien. Ils ont lieu grâce à trois mécanismes : la conjugaison, la transduction et la transformation naturelle. La transformation est possible lorsque la bactérie est dans un état de compétence. Notre bactérie d’étude, Streptococcus salivarius, est capable d’entrer naturellement dans un état de compétence. La transformation étant un processus énergivore et impactant le génome, ainsi que le cycle cellulaire, l’entrée en compétence est fortement régulée. S. salivarius possède deux niveaux de régulation : un niveau proximal, contrôlé par le système ComRS et un niveau distal, contrôlé par le système CovRS. Au cours de ce mémoire, nous nous sommes intéressés à la régulation distale de la compétence chez S. salivarius. Le système CovRS est composé de deux protéines. CovR est un régulateur de réponse qui lorsqu’il est phosphorylé agit comme un répresseur de nombreux gènes et notamment de comR nécessaire pour l’entrée en compétence. CovS est une histidine kinase (HK) associée à CovR et régule son état de phosphorylation suite à la détection de signaux extracellulaires. Une troisième protéine, CovM, est importante pour la régulation de comR par le système CovRS. En effet, l’inactivation de CovM, une protéine HK-like membranaire, induit une répression de comR et CovS est nécessaire pour observer cet effet de CovM. Ces différentes observations nous ont menés à nous interroger sur l’interaction potentielle entre CovM et CovS. L’objectif général de ce mémoire est d’étudier l’interaction entre CovM et CovS. Pour ce faire, nous avons utilisé le système Split-NanoLuc. Ce système permet de détecter l’interaction in vivo entre deux protéines grâce à la production de luminescence chez S. salivarius. Afin d’étudier cette interaction, nous avons, dans un premier temps, construit des contrôles négatifs adaptés. Nous avons testé l’interaction entre les deux protéines sauvages et avec des versions de CovM présentant des délétions croissantes de la partie cytoplasmique. Cette étude nous a permis d’observer une interaction entre nos protéines d’intérêt et l’importance de la partie cytoplasmique pour l’interaction. Nous avons également analysé l’impact de mutations ponctuelles de CovM sur la régulation de comR via des souches rapportrices possédant la fusion PcomRluxAB. Cette étude nous a montré que certaines mutations ponctuelles de CovM peuvent modifier la régulation de comR via le système CovRS. Enfin, afin de confirmer l’interaction entre CovM et CovS, nous avons déterminé les conditions nécessaires pour la production de ces protéines dans l’optique de réaliser une co-purification. Les résultats obtenus lors de ce mémoire ont permis de renforcer notre modèle d’une interaction entre CovM et CovS, ainsi que de confirmer le rôle de modulateur de CovM pour l’expression de comR. De plus, nous avons pu observer l’importance de la partie cytosolique de CovM pour son interaction avec CovS. Gene exchanges are frequent in the bacterial world. They take place via three mechanisms: conjugation, transduction and natural transformation. Transformation is possible when the bacterium is in a physiological state known as competence. The bacterial species of this study, Streptococcus salivarius, is capable of naturally entering a competence state. Since transformation is an energy-consuming process that affects genome integrity and cell cycle, the entry into competence is highly regulated. S. salivarius has two levels of regulation: a proximal level, controlled by the ComRS system, and a distal level, controlled by the CovRS system. In this master thesis, the work will be focused on the distal regulation of competence in S. salivarius. The CovRS system is composed of two proteins. CovR is a response regulator which, when phosphorylated, acts as a repressor of numerous genes, particularly comR that is required for competence activation. CovS is a histidine kinase (HK) associated with CovR, which regulates its phosphorylation state in response to extracellular signals. A third protein, CovM, is important for the regulation of comR by the CovRS system. Deletion of CovM, a membrane HK-like protein, results in comR repression, an effect that requires the presence of CovS. These observations led us to question a potential interaction between CovM and CovS. The main goal of this master thesis is to study the interaction between CovM and CovS. For this purpose, we will use the Split-NanoLuc system. This system detects in vivo the interaction between two proteins by producing luminescence in S. salivarius. To study this interaction, we first set up appropriate negative controls. We tested the interaction between the two wild-type proteins and versions of CovM with increasing truncations of its cytoplasmic region. This study allowed us to observe an interaction between CovM and CovS. It also showed the importance of the cytoplasmic part of CovM for its interaction with CovS. We also analysed the effect of point mutations in CovM on the regulation of comR using a reporter strain containing a PcomRluxAB fusion. This study showed that CovM point mutations can modify comR regulation through the CovRS system. Finally, to confirm the interaction between CovM and CovS, we determined the conditions necessary for the production of these proteins for future co-purifications. The results obtained during this work have strengthened our model of an interaction between CovM and CovS and confirmed the key role played by CovM as a modulator of comR expression. In addition, we were able to identify various parts of the cytoplasmic region of CovM as important for the interaction with CovS.