Régulateur du et par le facteur de transcription ZONAB : un stimulateur de la prolifération et un répresseur de la différence épithéliale

Details

Supervisors

Pierreux, Christophe ; Courtoy, Pierre Jacques

Faculty

Faculté de médecine et médecine dentaire

Degree label

Mémoire de master en sciences biomédicales (finalité spécialisée)

Abstract

Au cours de leur vie, les cellules épithéliales progressent d’un état prolifératif et indifférencié à un état différencié et polarisé permettant aux cellules d’assurer leurs fonctions. Au stade in situ des carcinomes épithéliaux, on observe la transition inverse : les cellules transformées perdent rapidement leur polarité, se dédifférencient et prolifèrent de manière autonome. En postulant l’existence de “master switches” transcriptionnels capables de promouvoir la prolifération des cellules tout en réprimant de manière simultanée les programmes de polarisation et de différenciation, le laboratoire d’accueil s’est intéressé au facteur de transcription ZONAB (ZO-1- associated Nucleic Acid Binding). A Faible densité cellulaire, ZONAB se localise dans le noyau et stimule l’expression de gènes impliqués dans la prolifération. A forte densité cellulaire ZONAB serait séquestré aux jonctions serrées, par association avec la protéine d’échafaudage ZO-1. Une alternative à ce modèle de translocation de ZONAB aux jonctions serrées est proposée par le laboratoire d’accueil. Dans trois systèmes différents, une relation inverse entre l’expression de ZONAB et la différenciation a en effet été observée, suggérant l’élimination de ZONAB lorsque les cellules se polarisent et se dédifférencient (à haute densité). En outre, le laboratoire a démontré qu’en plus d’être un stimulateur de la prolifération, ZONAB est un répresseur de la différenciation apicale. L’expression forcée de ZONAB dans des cellules différenciées change le devenir des cellules qui se dédifférencient et recommencent à proliférer. Bien que ces résultats démontrent que ZONAB est un « master switch » transcriptionnel, la régulation, les partenaires et les gènes de ce facteur de transcription ne sont pas bien connus. Afin de mieux comprendre la régulation du et par le facteur de transcription ZONAB, mon mémoire s’est attaché à obtenir et valider un outil multifonctionnel en utilisant la technologie HaloTag® de Promega. La première étape de mon mémoire a consisté en la construction de vecteurs permettant l’expression d’une protéine de fusion entre ZONAB et une halogénase « taggable » l’ HaloTag®. Les cDNAs de ZONAB de chien et de souris ont été amplifiés et clonés dans des vecteurs assurant l’expression à des niveaux variables de ZONAB en c- ou en N-terminal de l’ HaloTag®. J’ai ensuite vérifié l’expression des protéines de fusion ZONAB- HaloTag® par westernblotting sur des extraits de cellules BMEL transfectées de manières transitoire avec ces vecteurs. En utilisant les propriétés de l’HaloTag® et un ligand fluorescent, j’ai visualisé les protéines de fusion dans le cytoplasme mais également dans le noyau de cellules vivantes ou fixées ; une localisation comparable à ZONAB endogène. Enfin, j’ai démontré en transfection transitoire que ZONAB en fusion avec l’HaloTag® conserve ses propriétés de répresseur transcriptionnel sur deux gènes cibles connus. Ayant vérifié que notre outil, ZONAB- HaloTag®, se comporte comme la protéine ZONAB endogène, j’ai entamé l’étude de la régulation de et par ZONAB. En plus d’être visualisable, l’HaloTag® est précipitable (pull-down) ; une propriété utile pour l’identification de nouveaux partenaires protéiques mais également des gènes cibles de ZONAB. J’ai validé les expériences de précipitation en détectant deux partenaires connus de ZONAB (ZO-1 et la symplékine) associés à ZONAB-Halo Tag®, mais pas à l’HaloTag® seul. Ceci démontre que la fusion n’empêche pas ZONAB d’interagir avec ses partenaires protéiques. Finalement, j’ai réalisé une expérience de pull-down à grande échelle sur ZONAB-Halo Tag® qui valide cet outil pour l’identification de nouveaux partenaires de ZONAB par spectrométrie de masse. En conclusion, mo mémoire a fourni au laboratoire un outil fonctionnel qui permet l’identification de partenaires et qui pourra également être utilisé pour la recherche des gènes cibles de ZONAB