Étude in vitro des homologues de la lactate racémase de Clostridium asparagiforme

Details

Supervisors

Desguin, Benoît

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire

Abstract

Au sein de la classe des isomérases, les racémases et épimérases sont essentielles au métabolisme de nombreux êtres vivants. Parmi celles-ci, la lactate racémase (LarA), une métalloenzyme utilisant du nickel, catalyse la conversion des énantiomères du lactate. Mise en évidence chez Lactobacillus plantarum, la lactate racémase est codée par le gène larA et son activité requiert la présence d’un cofacteur organométallique appelé Nucléotide Pince à Nickel (NPN). La biosynthèse de ce cofacteur est assurée par 3 enzymes codées par les gènes larB, larC et larE. Les gènes lar sont largement représentés au sein des procaryotes. Sur 1087 génomes archéens et bactériens, près de 11% des génomes analysés présentent les 4 gènes lar (larA, larB, larC, larE) codant pour les éléments nécessaires à l’activité enzymatique Lar. Au total, plus de 370 homologues de LarA (LarAHs) ont été identifiés et catégorisés en 25 groupes phylogénétiques distincts, catalysant tous potentiellement des réactions autres que l’isomérisation du lactate. Avant ce mémoire, 7 LarAHs catalysant 5 nouvelles activités d’isomérisation d’acides α-hydroxylés avaient été caractérisés : deux malate racémases, une α-hydroxisocaproate racémase, deux gluconate épimérases, une α-hydroxyglutarate racémase et une phényllactate racémase. Cependant, l’étude des LarAHs n’en est qu’à ses débuts et pas moins de 9 LarAHs différents ont été identifiés chez Clostridium asparagiforme, une bactérie de notre microbiote intestinal. L’objectif de ce mémoire est donc d’étudier et de caractériser in vitro de nouvelles réactions d’isomérisation catalysées par les 9 LarAHs de C. asparagiforme. À cette fin, ces 9 LarAHs, nommés CLAS 1 à 9, ont été exprimés de manière hétérologue chez Escherichia coli puis purifiés. Les 9 gènes clas ont été amplifiés à partir du génome de C. asparagiforme pour être ensuite clonés avec succès dans E. coli. Suite à leur expression hétérologue, 7 de ces 9 CLAS étaient solubles et ont pu être purifiés correctement : les CLAS1, CLAS2, CLAS3, CLAS4, CLAS6, CLAS8 et CLAS9. Dans un premier temps, la spécificité de substrat de ces CLAS a été investiguée. Nous avons montré que les CLAS2 et 3 sont, comme suggéré par l’analyse du contexte génomique et par l’alignement de séquence, deux lactate racémases. Nous avons également découvert que le CLAS1 et le CLAS4 racémisent et épimérisent une large variété d’acides α-hydroxylés. Le CLAS1 et le CLAS4 appartenant à un même groupe phylogénétique, nous pensons que ce groupe puisse être une famille d’isomérases d’acides α-hydroxylés à large spectre. Concernant le CLAS6, le CLAS8 et le CLAS9, aucune activité n’a été détectée lors de cette étude. Dans un second temps, nous avons caractérisé le CLAS2 et le CLAS3 biochimiquement par test spectrophotométrique et électrophorèse capillaire. Nos résultats indiquent que CLAS2 possède une efficacité catalytique (kcat/KM) dix fois plus faible que le CLAS3. En outre, la stabilité ainsi que la température et le pH optimaux de chaque CLAS ont été déterminés. Dans l’ensemble, ce travail a mené à la caractérisation de deux nouvelles lactate racémases et à la découverte de deux nouvelles isomérases à large spectre NPN-dépendantes appartenant à la superfamille LarA chez C. asparagiforme.