Mécanisme d'activation des capteurs de phéromones ScuR et SarF dans le contrôle de la production de bactériocines chez Streptococcus salivarius

Details

Supervisors

Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité spécialisée: biotechnologie

Abstract

La résistance aux antibiotiques est une problématique de santé mondiale. En 2050, si aucune mesure n’est prise, l’antibiorésistance pourrait devenir la première cause de décès dans le monde. Des peptides antimicrobiens appelés bactériocines sont étudiés comme une alternative possible aux antibiotiques. La souche HSISS4 (isolat de l’intestin grêle humain) de Streptococcus salivarius (Ssa) a la capacité de sécréter des bactériocines ayant un effet bactéricide ou bactériostatique contre des bactéries pathogènes résistantes à de nombreux antibiotiques (ex. Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis). Dans cette souche, la sécrétion de bactériocines est couplée à l’enclenchement de la compétence par le système de signalisation ComRS. Deux protéines paralogues de ComR ont été identifiées, ScuR et SarF. Ces deux proteines peuvent induire la transcription des gènes sptA-sptB présent dans le même locus, qui d’après les prédictions, coderaient pour un transporteur ABC ayant des similarités avec un exportateur de bacitracines. De plus, grâce à une sélectivité stricte, ScuR permet de découpler prédation et compétence. Cette voie permettrait de mobiliser les bactériocines en minimisant l’apparition de mutations. Un peptide artificiel sBI7, ainsi qu’une séquence consensus permettant l’induction de ScuR et SarF, ont été mis en évidence à la suite d’un crible génétique. Néanmoins, les mécanismes par lesquels ScuR et SarF sont régulés de manière naturelle restent encore inconnus. Une étude antérieure d’un crible de mutants spontanés activant le promoteur PsptA (strictement contrôlé par ScuR/SarF) a permis d’identifier les gènes pepC, malQ et manL2 comme des gènes candidats régulateurs de ScuR et SarF. L’objectif principal de ce mémoire est de découvrir et de comprendre les voies de régulation naturelle de Ssa HSISS4 permettant l’activation du système ScuR/SarF. Pour ce faire, nous avons poursuit l’étude de mutants spontanés issus du crible. La caractérisation globale de l’activation de PsptA par le système rapporteur luciférase a permis la sélection de quinze clones présentant une diversité dans leurs phénotypes d’activation et non porteurs des candidats régulateurs préalablement identifiés. Pour ces clones, grâce à une banque de mutants de délétion des gènes scuR et/ou sarF, nous avons confirmé une l’activation de PsptA dépendante de ScuR et SarF. Le séquençage des génomes de ces quinze clones nous a permis d’identifier les gènes HSISS4_1091, aroA et leuA comme trois nouveaux gènes candidats régulateurs de ScuR et SarF. L’insertion individuelle de la mutation identifiée dans la souche de référence du crible nous a permis de valider l’implication de ces candidats régulateurs dans l’activation de PsptA. La construction de mutants de délétions pour les régulateurs nous a permis de démontrer une activation de PsptA dépendante du duo ScuR-SarF dans ces souches. Par la suite, la délétion totale et partielle des gènes candidats régulateurs nous a permis de confirmer l’implication des séquences peptidiques ressemblant à sBI7 dans les clones du crible, comme responsables du phénotype d’activation. La capacité d’activation de PsptA par ces séquences peptidiques a pu être confirmée par l’ajout au milieu de culture des peptides synthétiques correspondants. Enfin, nous avons cherché à valider l’implication biologique du candidat manL2 qui code pour une sous-unité du transporteur d’hydrate de carbone ManPTS2 dans la régulation de ScuR et SarF. Dans ce but, des constructions de surexpressions du gène manL2 et de la séquence manS correspondant au peptide potentiel d’activation de ScuR et SarF ont été réalisés. Néanmoins, la variabilité observée dans les tests d’activation de PsptA nécessiterons de plus amples recherches afin d’identifier les conditions optimales de culture requises pour la surexpression des éléments du ManPTS2. En conclusion, cette étude a permis d’améliorer notre compréhension de la régulation du système ScuR/SarF et ouvre la voie à une recherche plus approfondie des liens entre le système ManPTS et la prédation. Antibiotic resistance is a global health issue. In 2050, if no action is taken, antibiotic resistance could become the leading cause of death in the world. Antimicrobial peptides called bacteriocins are studied as a possible alternative to antibiotics. The HSISS4 strain (human small intestine isolate) of Streptococcus salivarius (Ssa) has the ability to secrete bacteriocins with a bactericidal or bacteriostatic effect against pathogenic bacteria resistant to many antibiotics (e.g., Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis). In this strain, bacteriocin secretion is coupled to the activation of competence by the ComRS signaling system. Two ComR paralogs have been identified, ScuR and SarF. These two regulators can induce the transcription of sptA-sptB genes located in the same locus, which are predicted to code for an ABC transporter with similarities to a bacitracin exporter. Moreover, through strict selectivity, ScuR allows the decoupling of predation from competence. This pathway would allow mobilization of bacteriocins with minimal mutation occurrence. An artificial peptide sBI7, as well as a consensus peptide sequence, were identified by a genetic screen for the induction of the ScuR/SarF system. However, the mechanisms by which ScuR and SarF are naturally regulated remain unknown. A previous study of spontaneous mutants activating the PsptA promoter (strictly controlled by ScuR/SarF) identified pepC, malQ and manL2 as candidate regulatory genes for ScuR and SarF. The general objective of this master thesis is to discover and understand the natural regulatory pathway(s) of Ssa HSISS4 allowing the activation of the ScuR/SarF system. For this purpose, we pursued the study of additional spontaneous mutants that emerged from the initial screen. The global characterization of PsptA activation using the luciferase reporter system allowed the selection of fifteen clones showing diversity in their activation phenotypes and not carrying the previously identified candidate regulators. For these clones, we confirmed ScuR- and SarF-dependent activation of PsptA thanks to the construction of a deletion mutant library of ScuR and/or SarF regulator(s). Sequencing of the genomes of these fifteen clones allowed us to identify HSISS4_1091, aroA and leuA as three new candidate regulatory genes. Individual insertion of the identified mutation in the reference strain of the screen validated the involvement of these novel candidates for PsptA activation. The deletion of the regulator(s) demonstrated a ScuR/SarF-dependent activation of PsptA in these strains. Subsequently, total and partial deletion of candidate regulatory genes confirmed the involvement of encoded peptide sequences ressembing to sBI7 as responsible for the activation phenotype. The ability of PsptA to be activated by these potential peptides was also confirmed by addition of the corresponding synthetic peptides in the growth medium. Finally, we investigated the biological involvement of the candidate manL2 encoding a subunit of the carbohydrate transporter ManPTS2 in the regulation of ScuR and SarF. For this purpose, overexpression constructs of the manL2 gene and the manS sequence corresponding to the potential ScuR/SarF-activating peptide were designed. Nevertheless, variablility in PsptA activation assays indicate that further investigation will be needed to optimize culture conditions for those overexpressions. Altogether, this study provides a deeper understanding of the regulation of the ScuR/SarF system, and paves the way for further investigation of the links between ManPTS and predation.