Dimérisation des protéines HOX : modalités et implications fonctionnelles

Details

Supervisors

Rezsohazy, René

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité didactique

Abstract

Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription (FT) essentiels au développement animal et à la formation de nombreux organes. Ils jouent notamment un rôle crucial dans l'établissement de l'identité segmentaire le long de l'axe antéro-postérieur (AP). Afin de remplir leurs fonctions, les protéines HOX se lient à l'ADN à l'aide de leur homéodomaine (HD). Or, l'extrême conservation de l'hélice 3 et la conservation générale de l'HD confèrent aux protéines HOX des propriétés similaires de reconnaissance de l'ADN. À l'exception de l'HD, les autres portions de séquence des protéines HOX sont prédites comme étant non structurées ou intrinsèquement désordonnées. Ce contraste entre la conservation de l’HD et la spécificité fonctionnelle des protéines HOX, appelé paradoxe des protéines HOX, soulève la question de comment ces protéines atteignent leur spécificité in vivo. Différentes hypothèses pourraient expliquer ce paradoxe, et dans le cadre de ce mémoire, nous nous sommes concentrés sur l'homo- et l'hétérodimérisation des protéines HOX. Une analyse monocellulaire de la moelle épinière de souris en développement a montré que seule une minorité de cellules n’expriment aucun ou un seul gène Hox, alors que la majorité des cellules en co-expriment de nombreux. En outre, des études précédentes ont démontré que la capacité d’homo- et d’hétérodimérisation est conservée au sein de la famille des protéines HOX de mammifères. Or, celles-ci restent très peu documentées dans la littérature. Il est donc particulièrement intéressant d’étudier les modalités ainsi que les implications fonctionnelles de ces dimérisations. Un des objectifs de ce mémoire était d’examiner l'impact de l’homo- et hétérodimérisation sur la capacité intrinsèque des protéines HOX à lier l’ADN. Pour cela, une optimisation des tests EMSA a été réalisée pour les protéines produites au départ des cellules HEK293T. Les protéines HOXA1 et HOXA5 ont ensuite été testées individuellement et en combinaison pour observer d'éventuelles modifications de leurs modes de liaison à l'ADN. Par ailleurs, Papadopoulos et al. ont montré que l’acide glutamique 19 de l’HD est crucial pour l’homodimérisation de la protéine Scr chez la drosophile (Papadopoulos et al., 2012). Des études préliminaires dans le laboratoire ont examiné si cet acide aminé joue un rôle similaire dans les interactions HOX-HOX chez la souris, sans détecter de perte de dimérisation (Duphénieux, 2024). Il a donc été décidé d’élargir la mutation et d'étudier des protéines HOX dépourvues de leur HD (HOX∆HD). Des expériences de co-précipitation (CoP) et de complémentation de fluorescence bi-moléculaire (Bimolecular Fluorescence Complementation ou BiFC) ont été réalisées afin d’évaluer l'importance de l'HD dans l’homo- et l’hétérodimérisation des protéines HOX. Les tests BiFC ont également permis de visualiser la localisation des dimères dans les compartiments subcellulaires. Les résultats indiquent que l’HD est essentiel à la localisation nucléaire, bien que les dimères formés entre une protéine wild type (WT) et une protéine ∆HD soient également localisés dans le noyau. Cela suggère que les protéines HOX pourraient être importées dans le noyau sous forme de dimères et que la protéine WT est capable de relocaliser le dimère dans le noyau. Des expériences d'immunofluorescence, de fractionnement cellulaire et d'imagerie de cellules vivantes couplées à la BiFC ont été menées pour examiner l'importance de l'HD et de sa troisième hélice dans la localisation intracellulaire. Elles ont également permis d'évaluer la capacité des protéines HOXWT à relocaliser les protéines ∆HD dans le noyau et à la chromatine. Ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur les mécanismes de liaison des protéines HOX entre elles et avec l’ADN, ainsi que sur leur importation dans le noyau. Toutefois, des expériences supplémentaires sont nécessaires pour approfondir et clarifier ces conclusions. Hox genes code for transcription factors (FT) essential for animal development and the formation of numerous organs. In particular, they play a crucial role in establishing the segmental identity along the antero-posterior (AP) axis. To perform their functions, HOX proteins bind to DNA using their homeodomain (HD). The extreme conservation of helix 3 and the general conservation of the HD give HOX proteins similar DNA recognition properties. With the exception of the HD, the other parts of the sequence of HOX proteins are predicted to be unstructured or intrinsically disordered. This contrast between the HD conservation and the functional specificity of HOX proteins, known as the HOX protein paradox, raises the question of how these proteins achieve their specificity in vivo. Various elements may play a part in the explanation, and for the purposes of this master thesis we have focused on the homo- and heterodimerization of HOX proteins. A single-cell analysis of the developing mouse spinal cord showed that only a minority of cells express one or none of the Hox genes, while the majority of cells co-express many of them. In addition, previous studies have demonstrated that the capacity for homo- and heterodimerization is a property widely shared among the mammalian HOX protein family. However, the functional consequences of these interactions remain poorly documented in the literature. It is therefore particularly interesting to study the modalities and functional implications of these dimerizations. One of the aims of this master thesis was to examine the impact of homo- and heterodimerization on the intrinsic ability of HOX proteins to bind DNA. To this end, EMSA assays were optimized for proteins produced from HEK293T cells. HOXA1 and HOXA5 proteins were then tested individually and in combination to observe any changes in their DNA binding modes. Papadopoulos et al. have shown that the glutamic acid 19 of the HD is crucial for Scr homodimerization in Drosophila (Papadopoulos et al., 2012). Preliminary studies in the laboratory showed that mutation of this amino acid does not lead to a loss of HOX-HOX interactions in mice (Duphénieux, 2024). It was therefore decided to enlarge the mutation and study HOX proteins lacking their entire HD. Co-precipitation (CoP) and Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC) experiments were carried out to assess the importance of HD in HOX homo- and heterodimerization. BiFC assays were also used to visualize dimer localization in subcellular compartments. The results indicate that the HD is essential for nuclear localization, although dimers formed between a wild-type (WT) protein and a protein without HD also localize in the nucleus. This suggests that HOX proteins may be imported into the nucleus as dimers and that the WT protein is able to relocalize the dimer in the nucleus. Immunofluorescence, cell fractionation, and BiFC coupled to live-cell imaging experiments were carried out to examine the importance of the HD and its third helix in intracellular localization. They also assessed the ability of HOX WT proteins to relocalize HD-deleted proteins to the nucleus and chromatin. These results provide new insights into the mechanisms by which HOX proteins bind to each other and to DNA and how they are imported into the nucleus. However, further experiments are needed to deepen and clarify these findings.