Évaluation d’une méthode de cryoconservation des tranches de précision de tissu adipeux de porc

Details

Supervisors

Debier, Cathy ; Rees, Jean-François

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité spécialisée: biotechnologie

Abstract

Longtemps considéré comme un tissu de stockage de graisses et de protection mécanique, le tissu adipeux se révèle être un organe complexe aux rôles multiples. Son métabolisme peut être perturbé par divers facteurs tels que des maladies ou l'exposition à des perturbateurs endocriniens, ce qui peut affecter l'ensemble de l'organisme. Son étude a nécessité le développement de modèles in vitro qui permettent de réaliser les expériences en conservant les interactions entre les cellules et les fonctions telles que présentes in vivo. C’est dans ce contexte que fut développé un modèle de tranches de précision de tissu adipeux de porc, en tant que modèle similaire à l’être humain. Ce modèle permet de travailler avec des échantillons standardisés et hautement reproductibles. Cependant, le tissu adipeux est souvent présent en grande quantité, et seule une petite partie de ce tissu peut être utilisée pour des expériences dans un délai suffisant pour sa survie. Ce mémoire de master visait à développer un protocole qui permettrait (i) une préservation à long terme du tissu adipeux par cryoconservation dans l’azote liquide ou (ii) une préservation à court terme du tissu adipeux par l’utilisation de culture retardée. Nous nous sommes principalement concentrés sur l’étude in vitro de la viabilité cellulaire par dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) libérée dans le milieu et l’étude de la fonctionnalité du tissu via la quantification du glycérol après induction de la lipolyse. Les tranches de tissu adipeux porcins ont été congelées en présence du composé cryoprotecteur DMSO, seul ou en association avec le tréhalose, pour une congélation directe ou différée après échantillonnage. Nous avons évalué l’impact de différents volumes de cryoprotecteur, ainsi que de 2 températures paliers (-20°C et -80°C) précédant le transfert dans l’azote liquide. La cryoconservation a été testée à la fois sur des tranches de tissu adipeux et des carottes de biopsies entières. Après décongélation, différents traitements (lipolyse non induite, induction directe de la lipolyse ou induction indirecte de la lipolyse après 24 heures de culture) furent appliqués afin d'évaluer les effets de ces paramètres. Nos résultats ont montré que la viabilité et l’activité lipolytique lors de la cryoconservation du tissu adipeux (tranches de précision et carottes de biopsie entières) est faible et peu fructueuse car, dans les deux cas, la fonctionnalité du tissu était perdue pendant ou après le processus de congélation/décongélation. Nous avons également révélé une diminution de la production de la LDH par le tissu au cours des expériences, ce qui nous a mené à douter que cet indicateur est approprié pour mesurer la viabilité des tranches de tissu adipeux. En ce qui concerne la conservation du tissu adipeux à court terme, via la culture retardée, l’étude a portée sur des carottes de tissu adipeux entières qui ont été incubées dans un milieu d’échantillonnage oxygéné pendant 24, 48 et 72 heures à différentes températures (4°C, température ambiante et 37°C) avant la mise en culture. Les résultats ont montré que la fonctionnalité du tissu a été significativement préservée au cours de la culture lors d’une incubation de 24h à température ambiante et jusqu'à 48 heures d’incubation à 37°C. Ces résultats sont encourageants pour un futur réglage des paramètres en vue d’optimiser le modèle, en dépit d’un protocole de cryoconservation non viable pour les tranches de précision du tissu adipeux porcin. Considered for a long time as a fat storage and mechanical protection tissue, adipose tissue turns out to be a complex organ with multiple roles. Its metabolism can be disrupted by various factors such as diseases or exposure to endocrine disruptors, which can affect the whole body. To study adipose tissue, the development of in vitro models was required. They allow experiments to be carried out while maintaining the interactions between cells and functions as they occur in vivo. In this context, a precision-cut adipose tissue slices model of pig, as model similar to the human being, was developed. This model allows to work with standardised and highly reproducible samples. However, adipose tissue is often present in large quantities, but only a small portion of this tissue can be used for experiments in a time frame sufficient for its survival. This master thesis aimed to develop a protocol that would allow (i) long-term preservation of adipose tissue by cryopreservation in liquid nitrogen or (ii) short-term preservation of adipose tissue by using delayed culture. We mainly focused on the in vitro study of cell viability by assaying the lactate dehydrogenase (LDH) released into the medium and the study of tissue functionality via the quantification of glycerol after induction of lipolysis. Porcine adipose tissue slices were frozen in the presence of the cryoprotective compound DMSO, alone or in combination with trehalose, for direct or delayed freezing after sampling. We evaluated the impact of different volumes of cryoprotectant, as well as two temperature steps (-20°C and -80°C) prior to transfer to liquid nitrogen. Cryopreservation was tested on both adipose tissue slices and whole biopsy cores. After thawing, different treatments (non-induction of lipolysis, direct induction of lipolysis or indirect induction of lipolysis after 24 hours of culture) were applied to evaluate the effects of these parameters. Our results showed that viability and lipolytic activity during cryopreservation of adipose tissue (precision slices and whole biopsy cores) is low and not very successful because in both cases the functionality of the tissue was not maintained during or after the freezing/thawing process. We also revealed a decrease in LDH production by the tissue during the experiments, which raises questions about the relevance of this indicator for measuring the viability of adipose tissue slices. Regarding the short-term adipose tissue preservation, via delayed culture, the study involved whole adipose tissue cores that were incubated in oxygenated sample medium for 24, 48 and 72 hours at different temperatures (4°C, room temperature and 37°C) prior to culture. The results showed that the functionality of the tissue was significantly preserved during culture when incubated for 24 hours at room temperature and up to 48 hours incubation at 37°C. These results are encouraging for future parameter tuning to optimise the model, despite a non-viable cryopreservation protocol for precision-cut slicing of porcine adipose tissue.