Étude des fonctions de Hoxa5 dans la synaptogénèse

Details

Supervisors

Gofflot, Françoise ; Bridoux, Laure

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité spécialisée: biotechnologie

Abstract

HOXA5 est un facteur de transcription de la famille des protéines HOX, qui joue un rôle dans le développement embryonnaire tel que le patterning le long de l’axe antéro-postérieure de l’embryon. Au sein du système nerveux central, l’expression d’Hoxa5 est dynamique au cours du temps et de l’espace. Elle débute au 9e jour embryonnaire au niveau de la future moelle épinière, s’étend dans le rhombencéphale postérieur et apparait également dans la région du pont. Dans le cerveau adulte, Hoxa5 est toujours exprimé au niveau des neurones du pont et des noyaux du rhombencéphale caudal selon le même patron qu’au stade fœtal tardif. La majorité de ces neurones appartiennent au système précérébelleux. Une analyse transcriptomique comparative dans un modèle murin avec une perte de fonction postnatale d’Hoxa5 (Hoxa5flox/flox; CMV-CreERT2) a permis d’identifier des gènes régulés en aval de la protéine HOXA5. Par «gene ontology», les fonctions principalement dérégulées au sein du modèle murin sont liées aux fonctions synaptiques (glutamatergiques et GABAergiques). Des gènes liés à des synapthopathies et notamment aux troubles du spectre de l’autisme ont également été mis en évidence. Ces données ont permis de poser l’hypothèse que le HOXA5 serait un régulateur de la formation et de la maturation synaptique au cours de la formation des circuits précérébelleux dans la période postnatale, dû à son domaine d’expression. L’objectif de ce mémoire est de participer au développement de modèles permettant, d’une part, d’étudier le rôle d’HOXA5 dans la synaptogenèse et, d’autre part, la caractérisation des circuits précérébelleux dans lesquels Hoxa5 est exprimé. Pour permettre d’étudier le rôle d’HOXA5 dans la synaptogénèse, le modèle in vivo a ses limites et il serait intéressant de travailler dans un modèle neuronal in vitro. La mise en place d’un protocole de culture neuronale primaire à partir du tronc cérébral de la lignée murine transgénique Hoxa5flox/flox; CMV-CreERT2 permettrait l’étude des fonctions d’Hoxa5 en inactivant son expression par l’hydroxytamoxifène. Ce type de culture n’est pas réalisé en routine contrairement aux cultures à partir de cortex et notre objectif est de développer ce protocole. Les cultures ont été réalisées à partir de tissus de troncs cérébraux prélevés à E17 sur une durée de 10 jours avec un changement de milieu de culture après 3 jours. Plusieurs paramètres ont été optimisés tels que la concentration des cellules pour l’ensemencement et l’utilisation d’un supplément de culture CultureOne. Ces paramètres ont permis d’améliorer la survie des neurones, la différenciation des neurites ainsi que de diminuer la proportion d’astrocytes dans les cultures. Hoxa5 est détecté dans les cultures du TC réalisées en suivant ce protocole. Il reste à caractériser les types neuronaux au sein de la culture et à mettre en place le protocole d’inactivation d’Hoxa5. Le second modèle proposé est une lignée murine transgénique Hoxa5-eGFP qui permettrait la localisation des neurones HOXA5+ du système précérébelleux et de leurs projections vers le cervelet. Ce modèle a été généré par insertion aléatoire d’un BAC permettant l’expression de la GFP sous les éléments de régulation du gène Hoxa5. Avant son utilisation, l’absence de surexpression des gènes du complexe HoxA qui ont été insérés avec le BAC doit être vérifiée. L’approche utilisée est celle de la RT-qPCR. Les résultats obtenus pour les gènes Hoxa3-Hoxa7 laissent penser qu’il n’y a pas de surexpression des gènes présents dans le BAC. Par la suite, il faudra également vérifier que la Gfp est bien exprimée et colocalisée avec les neurones Hoxa5+. HOXA5 is a transcriptional factor belonging to the HOX family. This protein plays critical functions in the embryonic development such as the patterning along the antero-posterior axes of the embryo. Hoxa5 is dynamically expressed in time and space in the central nervous system. The expression begins at the 9th embryonic day (E9) at the level of the future spinal cord, then later extends into the caudal hindbrain and in the pons region. In the adult brain, Hoxa5 is still expressed in the pontine neurons and in caudal hindbrain nuclei in the same pattern of expression as during the late fetal stage. Most of these nuclei are part of the precerebellar system. A comparative transcriptomic analysis in a conditional Hoxa5 loss-of-function murine model (Hoxa5flox/flox; CMV-CreERT2) allowed to identify genes regulated downstream of HOXA5. By Gene Ontology analysis, it was shown that the main dysregulated functions in this model are linked to the glutamatergic and GABAergic synapse. Genes associated to synapthopathies, such as genes relative to autistic spectrum diseases have been highlighted. These data allowed us to hypothesize that HOXA5 could be a regulator of synaptic formation and maturation during the precerebellar circuit formation due to its pattern of expression at this stage. The objective of this master thesis is to participate in the development of models enabling us to study the role of HOXA5 in synaptogenesis and to characterize the precerebellar circuit in which Hoxa5 is expressed. To be able to study the roles of HOXA5 in the synaptogenesis, it could be interesting to work with an in vitro model to bypass limitations of in vivo model. The implementation of a protocol of neuronal primary culture from brainstem of the murine transgenic line Hoxa5flox/flox; CMV-CreERT2 should allow studying the Hoxa5 functions by inactivating its expression with hydroxytamoxifen. Such brainstem cell culture is not currently done in comparison to cortical primary neuronal cultures. Our objective is to implement this protocol. The cultures have been realized from samples of E17 hindbrains and maintained for 10 days with a medium change after 3 days of culture. Different parameters have been studied such as the culture cell concentration or the use of the CultureOne supplement. These parameters allowed to increase the neuronal viability, neurites differentiation and to decrease the proportion of astrocytes in the culture. Moreover, we showed that HOXA5 is detected in these cultures. The characterization of neuron subtypes in the culture and the set-up of the protocol of inactivation of Hoxa5 remain to be done. The second model is a transgenic Hoxa5-eGFP murine line that could allow the localization of the HOXA5+ neurons in the precerebellar system and their projection into the cerebellum. This model has been generated by random insertion of a BAC that gives the ability to express GFP under the Hoxa5 regulatory elements. To validate this model, the absence of overexpression of genes from the HoxA cluster inserted with the BAC has to be done. A RT-qPCR approach was used for this characterization. Currently, the verification that Gfp is expressed and colocalizes with HOXA5+ neurons is under process.