Characterization of HOXA5’s interactions with SMAD1, SOX2 and TSHZ3 in post-natal and adult mouse brain

Details

Supervisors

Gofflot, Françoise

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

Hox genes, which encode transcription factors, play a major role during embryogenesis, especially in the establishment of the anteroposterior axis of the embryo. More recently, in our laboratory, it has been shown that the expression of several of these genes is conserved at the postnatal and adult stages. Indeed, 24 Hox genes remain expressed in the adult brain, mainly in the brainstem. Among these genes, Hoxa5 has a thirty-fold higher expression in the brainstem at the adult stage than that observed in whole embryo samples. Hoxa5’s expression pattern has been well established in the posterior brain, notably in several pre-cerebellar nuclei in the pontine region and the medulla oblongata. Thus, these data suggest late functions of HOXA5 in the formation, refinement and plasticity of pre-cerebellar circuits. Although new roles for HOXA5 are hypothesized, its mechanism of action remains to be determined. In this context, the study of functional partners, such as other transcription factors, appears to be essential in understanding the selectivity, affinity and binding specificity of HOX proteins. The objective of this master thesis is therefore to determine whether the selectivity and transcriptional activity of HOXA5 are influenced by SMAD1, SOX2 and TSHZ3, three transcription factors selected based on a yeast two-hybrid screen and by the analysis of interatomic analysis databases. In this project, we characterized their interactions with HOXA5 by answering three questions: The first question was to compare the expression pattern of the candidate interactants in the pons and medulla oblongata to that of the pattern of Hoxa5 by in situ hybridization technique. Previously, Sox2 and Smad1 had their transcripts detected in at least one of the Hoxa5- expressing nuclei, so Thsz3 was the only remaining gene that should have its expression pattern studied in these target regions of the hindbrain. Our initial results suggest that Tshz3 is expressed with Hoxa5 in several nuclei, belonging either to the precerebellar or autonomic systems. Then, our second question was based on the subcellular localization of HOXA5 and its potential interactants. We wanted to determine whether they were positioned in the same compartments, and could therefore meet in a cellular context and if their localization changes when expressed together. We found that all three selected partners could encounter HOXA5 in the nucleus and that HOXA5 could, in addition, encounter SMAD1 in the cytoplasm to potentially exert non-transcriptional functions. Finally, our third question concerned the interaction of HOXA5 with SMAD1, SOX2 and TSHZ3, and its impact on its transcriptional functions. We validated the interaction of TSHZ3 and SMAD1 with HOXA5 in vitro, but encountered technical difficulties preventing us from concluding whether SOX2 and HOXA5 could interact, although preliminary results may indicate an interaction. Then, we attempted to study the regulation of HOXA5 transcriptional activity with the potential partners, but we were unable to investigate this further due to problems intrinsic to our experimental setup. Taken together, these data offer new insights into the molecular mechanisms of HOXA5 in the brainstem, and the potential implications of HOXA5-assisting functional partners in the regulation of target gene expression. Les gènes Hox, qui codent pour des facteurs de transcription, jouent un rôle majeur durant l’embryogenèse, notamment dans l’établissement de l’axe antéropostérieur de l’embryon. Plus récemment, au sein de notre laboratoire, il a été mis en évidence que l’expression de plusieurs de ces gènes était conservée au stade postnatal et adulte. En effet, 24 gènes Hox restent exprimés dans le cerveau adulte, principalement dans le tronc cérébral. Parmi ces gènes, Hoxa5 possède, au stade adulte, une expression dans le tronc cérébral trente fois supérieure à celle observée dans les échantillons d'embryons entiers. Hoxa5 est exprimé selon un patron d’expression bien établi, notamment dans plusieurs noyaux pré-cérébelleux dans la région du pont et de la moelle allongée. Ces données laissent donc suggérer des fonctions tardives d’HOXA5 dans la formation, le raffinement et la plasticité des circuits pré-cérébelleux. Bien que de nouveaux rôles d’HOXA5 soient inférés, son mécanisme d’action reste à ce jour à déterminer. Dans ce cadre, l’étude de partenaires fonctionnels, tels que d’autres facteurs de transcription, apparait comme essentielle dans la compréhension de la sélectivité, l’affinité et la spécificité de liaison des protéines HOX. L'objectif de ce mémoire est donc de déterminer si la sélectivité et l’activité transcriptionnelle d’HOXA5 sont influencées par SMAD1, SOX2 et TSHZ3, trois facteurs de transcription sélectionnés sur base d’un criblage double hybride en levure et par l’analyse de banque de données d’analyses interactomiques. Au cours de ce mémoire, nous avons caractérisé leurs interactions avec HOXA5 en répondant à trois questions : La première question était de comparer le pattern d’expression d’Hoxa5 dans le pont et la moelle allongée à celui des candidats interactants par la technique d’hybridation in situ. Précédemment, Sox2 et Smad1 ont eu leurs transcrits détecté dans au moins un des noyaux exprimant Hoxa5, donc Thsz3 était le seul gène restant qui devait avoir son patron d'expression étudié dans ces régions cibles cerveau postérieur. Les premiers résultats que nous avons obtenus suggèrent que Tshz3 est exprimé avec Hoxa5 dans plusieurs noyaux, appartenant soit au système précérébelleux, soit au système autonome. Ensuite, notre deuxième question était basée sur la localisation subcellulaire de HOXA5 et de ses interactants potentiels. Nous voulions déterminer s'ils étaient positionnés dans les mêmes compartiments et pouvaient donc se rencontrer dans un contexte cellulaire, et si leur localisation change lorsqu'ils sont exprimés ensemble. Nous avons constaté que les trois partenaires sélectionnés pouvaient rencontrer HOXA5 dan