Test fonctionnel in vitro du gène STING1 comme candidat au développement de la Sclérose systémique héréditaire

Details

Supervisors

Limaye, Nisha

Degree label

Master [120] en sciences biomédicales, à finalité approfondie

Abstract

La Sclérose systémique (SSc) est une maladie auto-immune chronique rare caractérisée par des anomalies vasculaires, immunitaires, ainsi qu’une fibrose des tissus conjonctifs. Grâce à une collaboration avec des spécialistes de deux grands centres belges d’expertise, le laboratoire a eu accès à l'ADN sanguin de cinq familles dans lesquelles deux membres sont affectés par la maladie. Afin d'identifier de potentiels variants génétiques prédisposant à la SSc dans ces familles, un Whole Exome Sequencing (WES) a été effectué sur tous les échantillons disponibles, suivi d'une filtration des variants collectés. Le laboratoire a mis en évidence les variants étant : (I) partagés par les deux membres affectés, (II) absents à rares dans la population générale et (III) prédits in silico comme altérant la fonction protéique. Cette stratégie a permis d'identifier 29 à 48 variants par famille. Suite à l’absence de gène candidat commun entre plusieurs familles, une classification a été effectuée afin de mettre en évidence ceux dont : (I) les fonctions biologiques et (II) le profil d'expression étaient pertinents pour la maladie. Cette classification des 203 gènes candidats recensés a permis au laboratoire d’identifier des gènes appartenant à l'axe cGAS/STING-IFN-1 dans toutes les familles. Ceci suggère une voie de signalisation commune potentiellement impliquée dans le développement de la SSc héréditaire. L'objectif de mon mémoire était de réaliser des tests fonctionnels in vitro sur le variant identifié dans le gène STING1, un médiateur important de l’inflammation et de la production d'IFN-1. Pour évaluer l'impact de ce variant sur la fonction protéique, nous avons d'abord exprimé la protéine STING wild-type (WT) et celle associée à la SSc (p.R169W) dans les HEK293T et avons observé un effet de perte-de-fonction du variant lorsque la signalisation est induite. L’impact d’une perte de fonction de la protéine STING sur le développement de la maladie peut être expliqué par les travaux de Sharma et al. (2015) qui démontrent qu’en absence de STING, l’expression de régulateurs négatifs des récepteurs Toll-like (TLRs), à savoir A20, SOCS1 et SOCS3, est diminuée. Cette rupture d’inhibition potentialiserait ainsi l'effet de la signalisation des TLRs sur la production d'IFN-1 et de cytokines pro-inflammatoires. Afin de valider cette hypothèse, nous avons utilisé les THP-1 (une lignée monocytaire leucémique humaine) exprimant la protéine STING et certains TLRs. Après avoir supprimé l’expression endogène de STING1 en utilisant la technique CRISPR/Cas9, nous avons confirmé que l'activation de la voie cGAS/STING est effectivement abrogée dans les THP-1 STING KO en bulk. Nous avons ensuite démontré dans des clones STING KO que l’expression d’IFNβ1 et de certains régulateurs négatifs des TLRs (SOCS1 et A20), induite par la stimulation de la voie cGAS/STING, étaient diminués par rapport aux THP-1 WT. Enfin, nous réalisons la transduction virale de clones STING KO afin de réexprimer la protéine STING WT ou associée à la SSc, dans le but de : (I) confirmer l’effet perte-de-fonction du variant observé dans les HEK293T et (II) démontrer que le variant perte-de-fonction de STING potentialise l’effet de la signalisation des TLRs sur la production d’IFN-1, suite à une expression diminuée des régulateurs négatifs de ces derniers.