Etude moléculaire du mécanisme d'inhibition de l'activité des phospholipases lysosomiales induite par les aminoglycosides

Details

Supervisors

Tulkens, Paul M. ; Mingeot-Leclercq, Marie-Paule

Faculty

Faculté de médecine et médecine dentaire

Degree label

Mémoire de licence en technologie biomédicale

Abstract

Les nombreuses recherches réalisées ces dernières années sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui conduisent à la néphrotoxicité des aminoglycosides ont permis, en 1989, de proposer l’hypothèse suivante : les aminoglyccosides, en seliant aux phospholipides acides inclus dans les liposomes, diminueraient la charge négative portée par les bicouches lipidiques indispensable à l’activité optimale des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine Cette hypothèse simple a cependant dû être modulée suite aux résultats de travaux ultérieurs sur l’effet de la nature du phospholipide acide inclus dans la bicouche sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine et leur inhibition par les aminoglycosides. En affet, l’hydrolyse de la phosphatidylcholine est d’autant plus importante que les liposomes contiennent comme phospholipide acide de l’acide phosphatidique, de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol. Par ailleurs, alors que par filtration sur gel (Wagner, 1987) ou par équilibre de dialyse (Piret, 1989), les paramètres de liaison (Kd et Bmax) de la gentamicine à des liposomes chargés négativement apparaissent semblables quelque soit la nature du phospholipide acide inclus dans les bicouches, la gentamicine exerce un effet inhibiteur nettement moindre sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine lorsque les liposomes contiennent de l’acide phosphatidique plutôt que de la phosphatidylsérine ou plus encore du phosphatidylinositol. Ces résultats suggèrent d’une part, que l’activité des phosholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine est fonction de la nature du phospholipide acide inclus dans des liposomes et d’autre part qu’il n’y a pas de relation absolue et/ou directe entre la capacité de la gentamicine à se lier aux bicouches chargées négativement et l’effet inhibiteur de cet antibiotique sur l’activité des phosphatidylcholine. Ce dernier effet est d’ailleurs fonction, semble-t-il, d’autres paramètres comme l’accessibilité à l’eau de l’antibiotique inclus dans la bicouche lipidique. Grâce à la technique de partition entre deux polymères en phase aqueuse des différents types de liposomes préparés nous avons pu réaliser ce premier objectif et montrer qu’il n’existait pas nécessairement de relation absolue et/ou directe entre la charge négative portée par la bicouche lipidique et l’activité des phospholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine. En effet, la charge portée par la couche externe des liposomes semble moins importante lorsque le phospholipide acide inclus dans la bicouche lipidique est l’acide phosphatidylinositol et ce, quelque soit le pourcentage dephospholipide acide présent. Par contre, l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine est d’autant plus importante que les liposomes contiennent comme phospholipides acides de l’acide phosphatidique ou de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol. Selon ces résultats, l’activité des phospholipases lysosomiales serait donc inversement proportionnelle à la quantité de charges négatives portées par les bicouches. Néanmoins, avant de tirer une conclusion aussi hâtive, il faut noter que nos données sont en contradiction avec celles rapportées dans la littérature. En effet, il est connu que les phospholipides se répartissent de façon asymétrique entre la face interne et externe de la bicouche. L’acide phosphatidique, par exemple, serait localisé du côté externe de la membre, ce qui en accord avec le haut pouvoir fusogénique de ce phospholipide (Bondeson et. al, 1984). Par contre, la phosphatidylsérine serait localisée dans la monocouche interne des membranes cellulaires (op den kamp, 1979; Quist de Barker, 1983). Par ailleurs, les résultats de Jocelyne Piret (1989) ont montré que les paramètres de liaison décrivant l’interaction qui s’établit entre la gentamicine et les liposomes contenant les différents phospholipides acides ne présentent pas de différences importantes selon la nature du phospholipide chargé négativement considéré. Ceci suggérant l’absence de différence de répartition des liposomes chargés négativement par les différents phospholipides acides envisagés distribués entre le feuillet interne et externe. Enfin, il faut mentionner que les résultats de partition de liposomes chargés négativement entre deux polymères en phase aqueuse, s’ils se traduisent bien, pour un phospholipide acide donné, la quantité de ce phospholipide présent semble influencer par la nature de ce dernier. Si l’on ne comprend pas encore parfaitement l’influence de la nature d’un phospholipideacide inclus dans les liposomes sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine et de leur inhibition par les aminoglycosides, nous avons voulu dans un second temps, tester l’influence de la présence d’un ganglioside comme lipide chargé négativement. Les résultats obtenus montrent que la présence d’une charge négative n’est pas, en soi, un facteur suffisant pour augmenter l’activité des phospholipases lysosomiales via-à-vis de la phosphatidylcholine. De plus, nos travaux montrent, pour la première fois à notre connaissance, que les aminoglycosides peuvent se lier aux membranes qui contiennent des gangliosides. Cette liaison de la gentamicine aux liposomes contenant des gangliosides pourrait expliquer le pouvoir inhibiteur de cet antibiotique sur l’activité des phosphatidylcholine. Par ailleurs, le pouvoir inhibiteur de la gentamicine est fonction de la nature du lipide acide inclus dans les liposomes. Les aminoglycosides inhibent l’activité des enzymes lysosomiaux impliqués dans le catabolisme des phospholipides, c’est-à-dire les phospholipases A et C (Laurent et. al, 1982 ; Carlier et. al, 1983 ; Scwertz et. al, 1984 ; Lambricht et. al, 1986) et la syngomyélinase (Laurent et. al, 1982 ; Carlier et. al, 1983) provoquant ainsi l’accumulation de lipides comme la phosphatidylcholine, le phosphatidylinositol, la sphingomyéline. Vu le rôle important joué par les gangliosides dans plusieurs fonctions biologiques comme la communication intercellulaire, les réponses immunitaires, la régulation de la croissance et de la différenciation cellulaire, l’oncogénèse et modulation de signaux transmembranaires (Hakomori, 1981, 1986 ; Nudelman et. al, 1983 ; Weegant, 1985 ; Chan, 1987 ; Tsuji et. al, 1985), nous voudrions tester l’effet des aminoglycosides sur la dégradation des gangliosides car l’inhibition éventuelle de la ganglioside II³ Neu Ac-Gg4 Cer galactosidase ou un effet des aminoglycosides sur le cofacteur protéique nécessaire à l’hydrolyse du Gm1 pourraient avoir des conséquences importantes sur le fonctionnement cellulaire. A ce sujet, des études récentes ont apporté des résultats intéressants : d’une part Aslam et. al (1988) ont montré que l’administration de gentamicine à des rats (135 mg/kg de poids sec/jour) pendant vingt et un jour augmente de façon importante la quantité de gangliosides dans certaines parties du cerveau (la jonction et le colliculus inférieur). D’autre part, Kishore et. Al (1988) rappotent que la gentamicine ou la nétilmicine (10mg/(kg.jour) pendant 4 à 10 jours) augmentent le contenu du cortex rénal des rats traités en acide sialique qui est lié aux lipides et aux protéines. Ces observations pourraient résulter d’une perturbation dans le métabolisme des glycosides (et des glycoprotéines). Par ailleurs, vu effet important de la nature du lipide chargé négativement présent aux environs du substrat sur l’activité des phospholipases lysosomiales et leur inhibition par les aminoglycosides, nous aimerions tester, dans les mêmes conditions, l’effet des sulfatides. Au préalable, nous essayerons de caractériser la distribution des sulfatides au sein des membranes biologiques car ces lipides, tout comme les gangliosides, sont connus pour former des domaines. De plus, nous essayerons de mieux comprendre certains des résultats obtenus dans ce travail en étudiant par exemple l’asymétrie de distribution des phospholipides acides dans les membranes par résonance magnétique nucléaire et la formation de domaines de gangliosides par calorimètrie différentielle