Etude du système CovM-CovRS de régulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius

Details

Supervisors

Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

La compétence pour la transformation naturelle d’ADN chez Streptococcus salivarius est régulée de manière proximale par le système ComRS qui est induit par la présence de peptides de signalisation dans le milieu extracellulaire. Cette première couche de régulation est elle-même régulée par un système à trois partenaires (régulation distale) composé du système à deux composantes CovRS et de son modulateur associé, la pseudo-histidine kinase CovM. A ce jour, le fonctionnement du système CovM-CovRS reste encore très mal compris, tant sur son activé (kinase vs. phosphatase) que sur les interactions réalisées entre les partenaires. L’objectif principal de ce mémoire a été d’investiguer les interactions entre CovS, CovM et CovR, ainsi que de comprendre leurs impacts sur l’activation de la compétence chez S. salivarius. Tout d’abord, l’existence d’un système tripartite a pu être démontrée à l’aide de la technique du Split NanoLuc (alpha-complémentation). L’interaction entre CovM et CovS avait déjà été validée dans une étude antérieure. Dans ce travail, nous avons pu montrer que le régulateur de réponse CovR interagit avec l’histidine kinase CovS, mais également avec la pseudo-histidine kinase CovM. De plus, ce travail a permis de montrer que l’interaction entre CovR et CovM est dépendante de la présence de la protéine CovS, indiquant que CovM et CovR interagissent ensemble via l’intermédiaire de CovS. Collectivement, ces données confortent la présence d’un complexe tripartie mais dont la stœchiométrie devra être étudiée ultérieurement. Ensuite, des mutations ponctuelles ont été insérées afin de mieux comprendre le mécanisme par lequel ces protéines modulent le système ComRS via le contrôle de l'expression de comR. Les premières mutations qui se sont avérées intéressantes visaient à déstabiliser le dimère CovS-CovS en disruptant les interactions pi-soufre entre la phénylalanine 260 (F260) et trois méthionines (M231, M263, et M264) présentes dans le domaine HAMP. Les résultats les plus intéressants ont été obtenus avec la mutation F260A. Bien que cette mutation ne disrupte pas la formation du dimère CovS-CovS, elle semble entrainer un changement conformationnel qui augmente l’activité phosphatase intrinsèque de CovS. Par sa localisation dans le domaine HAMP, elle pourrait mimer l’activation du domaine receveur de CovS par un signal favorisant l’activité phosphatase. Par ailleurs, une autre mutation a mené à une augmentation de l’activité phosphatase de CovS. Il s’agit de la mutation de l’asparagine 367 (N367A) présente au niveau du motif de fixation du magnésium de CovM. Le magnésium, un cofacteur essentiel des histidines kinases classiques, permettrait de stabiliser la fixation d’ATP. Ce gain de fonction était inattendu pour une pseudo-kinase dépourvue d’histidine catalytique. Une hypothèse plausible serait que CovM soit dimérique et que la mutation N367A déstabiliserait le dimère CovM2. Cela pourrait augmenter la forme monomérique de CovM qui pourrait interagir avec CovS et moduler ainsi positivement son activité phosphatase. La déstabilisation du dimère CovM2 par la mutation N367A pourrait mimer un changement conformationnel qui ne prend place que quand CovM est activé par ses propres stimuli. Ce mémoire a donc permis de démontrer pour la première fois l’existence d’un complexe tripartite entre CovM, CovS et CovR. De plus, plusieurs mutations ponctuelles ont permis de mettre en évidence des gains de fonction qui ouvrent différentes perspectives quant au rôle des pseudo-histidine kinases comme modulateurs des systèmes à deux composantes chez les bactéries à Gram-positif. Competence for natural DNA transformation in Streptococcus salivarius is proximally regulated by the ComRS system, Induced by the presence of signalling peptides in the extracellular medium. This primary layer of regulation is itself modulated by a three-component system (distal regulation) composed of the CovRS two-component system and its associated modulator, the pseudo-histidine kinase CovM. To date, the functioning of the CovM-CovRS system remains poorly understood, particularly regarding its activity (kinase vs. phosphatase) and the interactions between its partners. The main objective of this master thesis was to investigate the interactions among CovS, CovM, and CovR, as well as their impact on the activation of competence in S. salivarius. Firstly, the existence of a tripartite system was demonstrated using the Split NanoLuc technique (α-complementation). The interaction between CovM and CovS had already been validated in a previous study. In this work, we showed that the response regulator CovR interacts with the histidine kinase CovS and also with the pseudo-histidine kinase CovM. Furthermore, this study demonstrated that the interaction between CovR and CovM is dependent on the presence of CovS, indicating that CovM and CovR interact via CovS. Collectively, these findings support the presence of a tripartite complex, though its stoichiometry remains to be further investigated. Secondly, point mutations were introduced to better understand the mechanism by which these proteins modulate the ComRS system via the control of comR expression. The first significant mutations aimed to destabilize the CovS-CovS dimer by disrupting π-sulfur interactions between phenylalanine 260 (F260) and three methionines (M231, M263, and M264) in the HAMP domain. The most intriguing results were obtained with the F260A mutation. Although this mutation did not disrupt the formation of the CovS-CovS dimer, it appeared to induce a conformational change that increased intrinsic phosphatase activity of CovS. Due to its location in the HAMP domain, this mutation may mimic the activation of CovS's receiver domain by a signal favouring phosphatase activity. Another mutation also led to increased CovS phosphatase activity: the mutation of asparagine 367 (N367A) in the magnesium-binding motif of CovM. Magnesium, an essential cofactor for classical histidine kinases, stabilizes ATP binding. This gain-of-function mutation was unexpected for a pseudo-kinase lacking a catalytic histidine. A plausible hypothesis is that CovM is dimeric and that the N367A mutation destabilizes the CovM dimer. This destabilization might increase the monomeric form of CovM, which could interact with CovS and positively modulate its phosphatase activity. The destabilization of the CovM dimer by the N367A mutation may mimic a conformational change that occurs only when CovM is activated by its specific stimuli. This thesis has thus demonstrated for the first time the existence of a tripartite complex between CovM, CovS, and CovR. Additionally, several point mutations revealed gain-of-function effects, opening new perspectives on the role of pseudo-histidine kinases as modulators of two-component systems in Gram-positive bacteria.